キメラ細菌の作製による病原細菌の宿主特異性決定機構の解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19446
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 堀口 安彦 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (00183939)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2020-03-31
• Keywords: 気管支敗血症菌 / パラ百日咳菌 / 細胞融合

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、病原性細菌の宿主特異性の決定機構を遺伝子レベルで解析することにある。この目的を達成するために、ヒトにのみ感染するパラ百日咳菌と広範な哺乳動物種を宿主とする気管支敗血症菌を融合させて、ヒト以外の実験動物に感染するキメラ細菌の作製を試みた。
パラ百日咳菌と気管支敗血症菌にトランスポゾンを用いてゲノムのランダムな位置に薬剤耐性遺伝子（それぞれゲンタマイシンとテトラサイクリン耐性遺伝子）を挿入したトランスポゾンライブラリーを作製した。それぞれのライブラリーから任意に分離したシングルクローンを融合実験に供した。基本的に、ライソゾームを用いてスフェロプラスト化した菌をポリエチレングリコールで融合するプロトコールで、各試薬の濃度や反応時間を変えて最適条件を探索した。得られた条件で融合実験を繰り返した結果、出発剤量の菌数の約0.01%程度の菌数の割合で、ふたつの薬剤に対しての耐性菌が分離できた。これらは目的の融合細菌であることが予想された。これらを3代まで継代したところ、6割程度の分離菌が継代後も生残した。これらをそれぞれの菌種特異的な遺伝子を標的にしたPCRと、パルスフィールド電気泳動でゲノム構造を調べたところ、いずれもゲノムが混合されることが推測できる結果を得ることができた。寒天培地上でのコロニー形状は、分離株によって異なっており、菌の性状も異なることが期待できた。これらの結果は、細菌細胞の融合技術に関して貴重な情報を提供すると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予想では、融合細菌の候補株が得られるまでに相当期間の予備実験が必要であると思われたが、実際には一定の割合で融合候補株がつねに回収でき、それを基準に条件検討ができたために予想よりも早期にプロトコールを確立することができた。一方、得られた融合候補株の解析に関しては、当初の予想よりも短いゲノム領域で組み換えが生じているらしいことが判り、そのため詳細な検討が必要であることが判った。その結果、多数の融合候補株のゲノム構造解析（次世代シークエンサーによらない）に手間取り、これに予想以上の期間を要しているため、全体的には当初の計画通りの進捗状況となった。

Strategy for Future Research Activity

これまでの成果により、融合細菌の作製プロトコールはある程度確立した。今後は例数を上げて、できるだけ融合候補株を集め、これらのゲノム構造を次世代シークエンサーによって解明する。それらの結果を総合して、キメラ細菌の作製プロトコールの確立とその性状の解明を目指す。

Causes of Carryover

本年度は予想よりもきわめて順調に融合細菌候補が得られ、既存資材で基本的な研究の遂行が可能であった。一方で融合細菌のゲノム構造解析には詳細な検討が必要であることが判明したため、以後の解析を中断して本年度と次年度で融合細菌候補を多数分離することとした。このため本年度の支出額を大幅に抑える結果となった。次年度は得られた融合細菌候補の全てを詳細なゲノム解析が可能な次世代シークエンサーに供試する予定である。このため本年度の未使用分は次世代シークエンサー使用料に当てる。