2018 Fiscal Year Research-status Report
generation of HLA homogenized iPS cell bank using induced homologous recombination method
| Project/Area Number |
18K19448
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
吉村 康秀 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60263307)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
|
| Keywords | iPS細胞 / 相同組換え / 染色体交差 / 再生医療 / ブルーム遺伝子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集技術を活用し、ブルーム蛋白インヒビターとトランスポゾンベクターだけを用いて『ゲノムに全く変異を与えることなく』、既存のiPS細胞から全てのHLA座位に関してホモ接合体を作製する手法を確立する事を目的とした本申請である。平成30年度においては、まずTet-offによるブルーム遺伝子の発現抑制によるHLA座位におけるホモ接合体の作製に成功した。次に、再生医療への展開を狙い、ゲノムを修飾してしまうTet-offに代わってブルーム蛋白インヒビター(ML216)の使用によるHLA座位におけるホモ接合体の作製にも成功した。この際、mRNAの発現が20%程度までしか抑制できないTet-offよりも、わずかながら高い効率でML216の使用によってホモ接合体が得られたが、ML216を用いたホモ接合体の作製に関して、作用時間及び濃度に関して現在さらなる条件検討を行っている。当該技術に関して、すでに確立している技術的内容に関して、【発明の名称】ホモ接合型細胞の作製方法（特願2018- 89779 ）として特許を出願中である。また本技術に関して、新規のデータを加えて特許強化を図るとともに、国際特許出願の準備も大阪大学産学共創本部の支援を受けて進めている。さらに、本技術に関して汎用性の証明と再生医療への適用を鑑みて、成育医療研究センターとヒトES細胞を用いて共同研究を開始することを決定し、すでに臨床応用が開始されている株（SEES2）を用いたHLAホモ接合体の作製を開始している。また、本申請のもう一つの目的である、病因領域特定技術の構築に関しても、連携研究者の井川（獨協医科大学）のみならず、成育医療研究センターが保有している、病因領域が特定されていない患者由来のiPS細胞を用いて、研究開始を検討している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
条件検討の結果、染色体切断のためのCRISPR/Cas9及びG418とpuromycinによるダブルセレクションを可能にするためのCreリコンビナーゼのトランスフェクションを行う前の24時間と、後の48時間にブルーム蛋白インヒビター(ML216)を作用させることにより、Tet-offと同等以上の効率でHLA領域のホモ接合体が得られることが判明した。一方で、HLA領域を持つ6番染色体短腕で実験を行う前に、モデルとして行った19番染色体における結果から、染色体交差は切断点近傍だけでなく、それが特異的に生じるゲノム領域が存在する可能性が示唆された。より高効率でホモ接合体を得る条件を見出すため、今後はさらなるML216の使用条件の検討を行うとともに、特異的に染色体交差が生じる領域の解析も行ってゆく。
|
| Strategy for Future Research Activity |
iPS細胞に関しては、これまで我々が保有する1株のみによる研究であった。システムの汎用性を確認するためにも、他のiPS細胞株でも研究を行うのと並行し成育医療研究センターとの共同研究で、ヒトES細胞を用いた研究にも着手する。これにより、ブルームの抑制による染色体交差頻度の上昇が、stem cellで普遍的に生じていることを確認するとともに、ヒトES細胞におけるブルーム蛋白インヒビター(ML216)の使用条件を確立する。なお、ヒトES細胞の使用に関する文部科学省への使用計画届出書に関しては、成育医療研究センターを通じて提出済みである。
|
| Causes of Carryover |
当初予定していた、細胞培養用のCO2インキュベーター（920千円）が、共同研究者のものが使用できるようになったため購入する必要がなくなった。この分に関しては、新たに共同研究を開始する成育医療研究センターへの出張旅費、及びそれに関連して必要となったヒトES細胞培養用試薬類の購入に充てることとしている。
|
Research Products
(1 results)
