2019 Fiscal Year Research-status Report

新たな細胞医薬戦略を目指した体細胞復帰変異発生機序の解析と制御法の開発

Research Project

Project/Area Number	18K19540
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	秋山真志名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (60222551)
Project Period (FY)	2018-06-29 – 2021-03-31
Keywords	遺伝子 / 角化 / 魚鱗癬 / モザイク / 復帰変異
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、先天性魚鱗癬の一種であるichthyosis with confetti（IWC）に着目した。この疾患では、異常な高頻度で「体細胞復帰突然変異によるモザイク現象」（revertant somatic mosaicism, RSM）を生じている。RSMを起こした健常組織は、患者本人の細胞からなり、一般に免疫原性が認められない為、細胞医薬として理想的である。IWCでは、原因遺伝子KRT1、KRT10の特定の領域に変異が集中するが、RSMが高頻度に生じる理由は不明である。本研究では、IWCのモデル細胞系とモデル動物系を世界に先駆けて作成し、それらの系を用いて、RSMの分子的機序の解明を目指した。具体的には、以下の二つのプロジェクトを行った。 (1)不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築：KRT1のゲノムサイズは約4.5kbと小さく、in situでの遺伝子操作に極めて適しているため、KRT1変異によるモデル系の作成を行った。KRT1遺伝子にCRISPR-Cas9によるヘテロ接合性遺伝子変異導入を行い、野生型および変異KRT1を有する不死化ケラチノサイトを作成し、それぞれ異なる蛍光蛋白で標識した。これらのIWCモデル細胞をスクリーニング系として、RSMを促進する条件についてのケミカルクスリーニング、DNAストレス、siRNAスクリーニングなどの各種スクリーニングプラットホームの構築を試みた。 (2)薬剤投与により誘導可能なIWCモデルマウスの作成：CRISPR-Cas9によりKrt1-EGFPノックインマウスの作成を行った。表皮特異的CreER発現マウスは購入し、4-OHT誘導性mRFPおよび変異KRT1発現カセットをCRISPR-Cas9によるゲノム編集によりヘテロ接合性に導入したマウスを、上記２種のマウスと掛け合わせることにより、IWC症状を薬剤誘導性に発症するモデルマウスの作成を試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究計画では、KRT1遺伝子の変異をCRISPR-Cas9によりヘテロ接合性に導入し、変異KRT1を有する不死化表皮細胞を作成し、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞をスクリーニング系として樹立する計画であった。しかし、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞が、培養条件のためか、予定通りに樹立できず、復帰体細胞変異を促進する条件についてのスクリーニングプラットホームの構築のための事前調査に想定以上の時間を要した。そのため、研究計画全体に、やや遅れを生じた。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究において、具体的には、以下の二つのプロジェクトを推進する方針である。 (1)不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築：これまでの研究の若干の遅れのため、本研究でのKRT1変異によるモデル細胞系の作成実験の一部が、未施行の状態である。この未施行部分を、令和２年度の前半に行い、KRT1遺伝子にCRISPR-Cas9によるヘテロ接合性遺伝子変異導入を行い、野生型および変異KRT1を有する不死化ケラチノサイトを作成し、それぞれ異なる蛍光蛋白で標識したIWCモデル細胞を完全に樹立する。その細胞をスクリーニング系として、RSMを促進する条件についてのケミカルクスリーニング、DNAストレス、siRNAスクリーニングなどの各種スクリーニングプラットホームを完成させる。 (2)RSM発生の分子機序の解析とRSMの発生を制御しうる低分子化合物の探索：上記モデル細胞系を用いて、種々の条件下でのRSM発生頻度、発生機序を解析する。さらに、低分子化合物ライブラリを用いたスクリーニングにより、RSMの発生を制御しうる低分子化合物を探索する。
Causes of Carryover	本研究計画では、KRT1遺伝子の変異をCRISPR-Cas9によりヘテロ接合性に導入し、変異KRT1を有する不死化表皮細胞を作成し、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞をスクリーニング系として樹立する計画であった。しかし、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞が、培養条件のためか、予定通りに樹立できず、復帰体細胞変異を促進する条件についてのスクリーニングプラットホームの構築に想定以上の時間を要した。そのため、研究計画の進展に遅延を生じ、次年度使用額が発生した。それらの次年度使用額は、不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築と、それらモデル細胞系とスクリーニングプラットホームを用いた、種々の条件下でのRSM発生頻度、発生機序の解析と、低分子化合物ライブラリを用いたスクリーニングに使用する計画である。