2018 Fiscal Year Research-status Report
代謝酵素ゲノム編集による食道扁平上皮の易発がん状態誘発の試み
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18K19577
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
源 利成 金沢大学, がん進展制御研究所, 教授 (50239323)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大黒 多希子 金沢大学, 学際科学実験センター, 教授 (30767249)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 食道 / 扁平上皮がん / 発がん / 糖代謝酵素 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は食道扁平上皮発がん開始に伴う細胞内グリコーゲン低下、消失が発がんの初期選択圧力であると想定し、グリコーゲン合成系代謝酵素のゲノム編集による扁平上皮自然発がん易誘発状態の細胞・マウスモデル創出を試みる。これにより、発がん剤なしにヒトがん化過程を外挿する食道扁平上皮がんモデル開発に資する食道粘膜易発がん状態の誘導に挑戦する。本研究は食道と頭頚部扁平上皮がんの連鎖に代表されるフィールドがん化現象と、細胞、組織の分化や発がんにおけるグリコーゲン合成系の新たな生物学的機能の一端を拓く可能性を秘めている。
本年度は下記の研究計画を実施した。
(1) 正常ヒト食道扁平上皮細胞のGS欠失やGSK3β恒常的活性化による細胞形質変化の解析
CRISPR-Cas9システムでGSを欠失させるためのガイドRNAを設計し、プラスミドを構築した。また、GSK3βの第9セリンをフェニルアラニンに置換した恒常的活性型GSK3βS9Fの発現プラスミドを構築した。まず、形質転換効率の高い細胞を用いて各プラスミドのゲノム編集効率を確認した。そして、食道がん切除検体の非がん部から扁平上皮初代培養細胞を調整し、遺伝子導入とスクリーニングを開始した。
(2) マウス食道粘膜のGS欠失やGSK3β恒常的活性化による細胞分化や前がん性変化の解析
C57BL/6マウスの扁平上皮特異的にGSを欠失させるために必要となるK5 promoter-CreマウスとGS-floxマウスを作出して、その遺伝子型を確認し、これらのマウスの交配によるGSヘテロ欠損マウス(F1)の作製に着手した。また、扁平上皮特異的に活性型GSK3βS9Fを発現させるため、GSK3β-floxマウスにK5 promoter-loxP-stop-loxP-GSK3βS9F（コンストラクト構築中）を導入し、K5-Creマウスと交配する計画を立案した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
細胞の代謝酵素ゲノム編集の実験は当初の計画通りに進められた。
マウスゲノム編集に必要とするK5プロモーター遺伝子を理化学研究所から、そして遺伝子組換えGS-floxマウスとK5-Creマウスをそれぞれバルセロナ医生物学研究所と熊本大学生命資源研究・支援センターから入手する過程で、研究試料の提供に関する覚書所（MTA）などの手続きに時間を要した。また、バルセロナから遺伝子組換えマウスの輸送の際に、相手方の書類の不備のため本学への搬送が遅くなり、交配実験が予定より大幅に遅れた。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR-Cas9によるGS欠失や恒常的活性型GSK3βを導入した正常ヒト食道扁平上皮細胞の樹立を継続して試みる。初代培養細胞に対しては遺伝子導入効率が低いため、異なるトランスフェクション法やスクリーニング法を並行して検討し、細胞樹立までの短期化を図る。そして、クローン化したゲノム編集細胞のグリコーゲン量、糖代謝特性、増殖・コロニー形成などを正常細胞と比較し、グリコーゲン代謝酵素のゲノム編集によるがん化への影響を細胞レベルで検証する。
扁平上皮特異的なGS欠損マウスと恒常的活性型GSK3βトランスジェニックマウスの作製を引き続き推進する。また、次年度からGSヘテロ欠損マウスおよびホモ欠損マウスを対象に、GSの上皮での遺伝子欠損を免疫染色などで確認する。そして、GSヘテロ欠損マウスを対象に、組織学的な形態観察と食道粘膜層のヨード染色により、GSの欠失に依存する前がん性変化の検証を開始する。
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Research Products
(9 results)
