ブタを足場としての再生医療とバイオ臓器の開発における内在性レトロウイルスの制御

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19579
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2021-03-31
• Keywords: PERV / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞 / Dol-P-Man

Outline of Annual Research Achievements

ブタを足場としてヒトの臓器を作らせる再生医療、およびバイオ人工臓器の開発が進んでいる。しかし、今だブタ内在性レトロウイルス（PERV）の問題が取りざたされている。研究の目的はPERV感染の可能性の少ないブタを作る事である。一方世界的には、CRISPR/Cas9法により、米国のVentureが既にPERV-KOブタを開発し、ドイツではPERV-CのKOブタを開発している。しかし、これらにはCas9法の特許の問題が絡んでいる。
我々は、このCas9法を避けて、CRISPR/Cas3法によるブタ作りを試みている。Cas３法で先ずは検定しやすいGalTのKOを試みた。Exon9をtargetに５’、３’側にsite（#45と#86）を設定し、そのKO効率を検定した。（6x105個の）ブタ線維芽細胞に、pX-Cascade,BPNLS-hCas3,pBS-U6-crRNAをそれぞれ0.5ul導入する方法をとり、結果的に９つ（#45:2,#86:2, #45+#86:5）のコロニーを作出し、Sequenceで294-754bpのdelを確認している。
またさらに、Hanganutziu-Deicher抗原の遺伝子CMAHに対しても、同じく、Exonの２箇所にsiteを設定し、pBS-U6-crRNAを作出した（#52と#64）。
一方、ブタのDol-P-Manに関しては、Cas３法でKOすべく、NIH databaseより各Exonの位置を割り出し、siteを設定して、現在pBS-U6-crRNAを作成している。これには、PERVを自然に放出している細胞のline（PK15: 腎由来株）での検定を予定している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CRISPR/Cas3法のブタ細胞での困難性。恐らく、遺伝子導入した結果として、小さなdelしか出来ないCas9法に比して、Cas3法では、今回294-754bpのdelを確認した様に、多くの場合約300bp以上のdelが発生し、細胞の核に対してかなりのダメージを与え、それに伴いアポトーシスを誘導し、結果的にKO細胞のcloningの効率が落ちていることが考えられた。

Strategy for Future Research Activity

CRISPR/Cas3法の継続、つまりこの方法でPK15細胞のDol-P-Manをtargetし、ヒト細胞（293T）と協培養し、PERV感染率の変化を検定する方法をとる。
また、新しいKO法、例えばCas12a(Cpf1)の場合はcrRNA が41-44bpでありオフターゲット効果が少ない事になるが、PAM siteがTTTVと特殊で、切断効率はCas9より落ちるとされている。この様な方法も取り入れて、PERV感染の縮小化を進める予定である。

Causes of Carryover

遺伝子導入した結果として、小さなdelしか出来ないCRISPR/Cas9法に比して、CRISPR/Cas3法では、今回確認した様に約300bp以上のdelが発生し、細胞にかなりのダメージを与えアポトーシスを誘導することが考えられた。このため、研究が遅れている状態である。
しかし、CRISPR/Cas9法には特許の問題が絡んでいるため、今後もCRISPR/Cas9法、その他の方法で研究を進めていく予定である。

Research Products

• [Journal Article] The strategy for suppression of macrophage-mediated rejection in xenotransplantation. (2020)
  • Author(s): Akira Maeda, Hiroshi Eguchi, Kengo Nakahata, Takuji Kawamura, Kazuaki Yamanaka, Rei Matsuura, Rieko Sakai, Peichi Lo, Mayumi Asada, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Journal Title: Transplantation Volume: 104 Pages: 675-681
  • DOI: 10.1097/TP.0000000000003024.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The novel immunosuppressant prenylated quinolinecarboxylic acid-18 (PQA-18) suppresses macrophage differentiation and cytotoxicity in xenotransplantation (2019)
  • Author(s): Lo PC, Maeda A, Kodama T, Takakura C, Yoneyama T, Sakai R, Noguchi Y, Matsuura R, Eguchi H, Matsunami K, Okuyama H, Miyagawa S.
  • Journal Title: Immunobiology Volume: 224 Pages: 575-584
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human TIGIT on porcine aortic endothelial cells suppresses xenogeneic macrophage-mediated cytotoxicity. (2019)
  • Author(s): Yuki Noguchi, Akira Maeda, Pei-Chi Lo, Chihiro Takakura, Tomoko Haneda, Tasuku Kodama, Tomohisa Yoneyama, Chiyoshi Tomiyama, Yuko Tazuke, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Journal Title: Immunobiology Volume: 224 Pages: 605-613
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The strategies for preventing the macrophage-mediated rejection in xenotransplantation (2019)
  • Author(s): Akira Maeda, Peichi Lo, Rieko Sakai, Yuki Noguchi, Tasuku Kodama, Rei Matsuura, Tomohisa Yoneyama, Chihiro Takakura, Hiroshi Eguchi, Masahito Watanabe, Hiroshi Nagashima, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: Asia Pancreas and islet Transplantation Association
  • Invited
• [Presentation] The novel immunosuppressant PQA-18 suppresses macrophage differentiation and cytotoxicity in Xenotransplantation (2019)
  • Author(s): Pei-Chi Lo, Akira Maeda, Chihiro Takakura, Yuki Noguchi, Chiyoshi Tomiyama, Tomohisa, Yoneyama, Ktsuyoshi Matsunami, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 15th International Xenotransplantation Association
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Human TIGIT on swine endothelial cells suppresses xenogeneic macrophage-mediated cytotoxicity (2019)
  • Author(s): Yuki Noguchi, Akira Maeda, Pei-Chi Lo, Chihiro Takakura, Tomoko Haneda, Tasuku Kodama, Tomohisa Yoneyama, Chiyoshi Tomiyama, Yuko Tazuke, HIroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 15th International Xenotransplantation Association
  • Int'l Joint Research
• [Book] 2nd. Comprehensive Glycoscience (2020)
  • Author(s): Shuji Miyagawa. Xenotransplantation and glycomedicine 2nd. Comprehensive Glycoscience. Johannis P Kamerling (Eds.) ELSEVIER Press.
  • Total Pages: Un know
  • Publisher: ELSEVIER Press
• [Book] Open access Publisher INTECH (2019)
  • Author(s): Xenotransplantation - Comprehensive Study
  • Total Pages: 143
  • Publisher: INTECH