2018 Fiscal Year Research-status Report

移植可能な真の代替肝臓の開発を目指した胆汁産生と排泄機能復元への挑戦

Research Project

Project/Area Number	18K19592
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	八木洋慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20327547)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	須藤亮慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 准教授 (20407141) 水口裕之大阪大学, 薬学研究科, 教授 (50311387)
Project Period (FY)	2018-06-29 – 2021-03-31
Keywords	胆管再生 / 細胞外マトリックス / 胆管上皮細胞
Outline of Annual Research Achievements	【背景】肝再生医療の実現化に胆汁産生と排泄機能は必須の課題である。しかし、これまでに有効な手段は示されていない。脱細胞化骨格は、生体組織から細胞を洗浄除去することで得られる立体構造であり、我々はこの骨格内に充填した肝細胞が体内に移植後に胆汁産生を開始することを見出したが、排泄経路の再生には至っていない。今回、ラットの分離新鮮胆管上皮細胞を用いて骨格内での胆管構造再生の可能性について検証した。【目的】ラット肝臓の門脈・胆管アクセスを確保して脱細胞化し部分肝に成形した。別のラットの肝臓から理工学部の須藤研の協力を得て、胆管樹枝状構造から分離した新鮮胆管上皮細胞を脱細胞化肝臓の胆管に注入し、経門脈的または経胆管的に循環培養を行った。培養後の胆管構造をHE染色、サイトケラチン19(CK19)による免疫染色および蛍光標識細胞を用いた三次元画像解析によって評価した。【結果】経門脈的に循環培養を行った細胞と比較して、最適化した経胆管的循環培養法を用いた細胞はより多く胆管上皮細胞が胆管内壁に生着し、三次元解析で立体的樹状構造を示した。更に本手法を用いてブタ肝臓骨格でも同様に胆管の立体構造の構築が可能であった。【結語】ラットおよびブタの肝脱細胞化骨格内の残存胆管構造において、胆管上皮細胞の生着と立体構造の構築が確認された。一方、胆汁の排泄自体は未確認であり、生体内における長期的な胆管上皮細胞の生着も検証が必要である。今後、各種細胞と共培養した上で生体内でのグラフト機能を検討していく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 理工学部の須藤らの協力の元、新鮮胆管上皮細胞の分離技術を確立し、脱細胞化骨格へ注入、培養する条件（速度、細胞数、圧）を最適化し得た。確立した手法を用いて、当初予定通り分離した新鮮胆管上皮細胞を、脱細胞処理したラットおよびブタ骨格に残存する胆管構造から注入し、立体構造を共焦点顕微鏡で確認し得た。また更に他の肝構成細胞（肝細胞・血管内皮細胞）と共に三次元循環培養装置内で培養し、内部構造を経時的に評価することができた。これらの結果は、2019年3月の日本再生医療学会にて報告を行い、これまで困難であった胆管の樹枝状構造を再現したことで、多くの反響をいただいた。まず初年度として結果をまとめ学会発表レベルの成果として創出できたことは、おおむね順調な研究の進展状況を表していると考えている。
Strategy for Future Research Activity	2018年度の結果を踏まえて、胆管上皮細胞を肝臓骨格内でより長期に培養し、胆汁産生や細胆管発生、微絨毛の発現を含めた胆管上皮細胞の機能的再生を継時的に検証し、まず新鮮細胞を用いた基礎的エビエンスを蓄積する。その後、東京大学の宮島らの協力を得て、ヒトiPS細胞から分化誘導した結果得られた成熟胆管上皮細胞を、2018年度に確立した手法を用いて、脱細胞処理したラットおよびブタ骨格に残存する胆管構造から注入し、立体構造を共焦点顕微鏡で確認する。また更に他のヒトiPS細胞由来肝構成細胞（iPS由来肝細胞・iPS由来血管内皮細胞）と共に三次元循環培養装置内で培養し、内部構造を経時的に評価する。まずラットの小スケールでiPS細胞の注入による評価を行ったのち、スケールアップしたブタ骨格を用いて同様の胆管構造の復元が可能かどうかを検証する。
Causes of Carryover	ブタ胆管上皮細胞への注入と条件検討の部分で、予定よりも少額の培養関連試薬で実行可能であったため、わずかに研究費に余剰が発生した。この余剰額を次年度に使用することで、ブタの胆管上皮細胞の注入実験回数を増やし、また評価系をより充実化すること（病理学的、電子顕微鏡など）が可能となるため、本実験の結果の確実化がさらに期待できる。以上のように研究をより加速・充実化するために剰余額を次年度に有効に活用する予定である。