MRSA特異的な3D転換性DNAアプタマー型抗菌薬の構築と開発技術の確立研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K19638
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中馬 吉郎 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (40372263) ; 土門 久哲 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00594350) ; 前川 知樹 新潟大学, 医歯学系, 研究准教授 (50625168) ; 米澤 大輔 新潟大学, 医歯学系, 助教 (90711896)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2020-03-31
• Keywords: MRSA

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，MRSAのペニシリン耐性を担うPBP2’タンパク質（変異型）と 薬剤感受性の黄色ブドウ球菌のPBPタンパク質（ノーマル型）をヒスチジンタグの組換え体として発現させ，同タグ精製用のアフィニティーカラムにそれぞれ吸着させる．網羅的に人工合成した約40塩基のDNA配列をPBPカラムで吸着ろ過させた後，未反応DNA液をPBP2’カラムに吸着させることで，“PBP2’特異的なDNAアプタマー群”を得る．続いて，一価の陽イオン依存的に立方体構造へと変化するDNA配列群を検索後，PBP2’特異的なDNAアプタマーと連結し，「DNA素材のMRSA抗菌薬候補群」とする．そして，in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し，DNA製抗菌薬の構築サイクルを確立させることを目的とする．具体的な初年度の結果を以下に記す．
1. 約40塩基長のDNA鎖を網羅的に人工合成した．その際に，後の配列決定を考慮し，シークエンスタグをDNA鎖の両端に付加し，DNAアプタマーライブラリとした．2. 薬剤感受性の通常型の黄色ブドウ球菌を基に，ノーマルなPBPの組換えタンパク質を作製した．併せてMRSAを基に，薬剤耐性に変異したPBP2’の組換えタンパク質も作製し，それぞれを精製用のアフィニティ－カラムに吸着させた．3. DNAアプタマーライブラリをノーマルのPBPアフィニティ－カラムに通した後，未反応画分を耐性因子PBP2’のアフィニティ－カラムと反応させた．吸着したDNAは，シークエンスタグを利用して塩基配列決定した4. 上記の1～3を20回繰り返し，PBP2’へ特異結合するDNA群を配列データと共にプールした．5. 上記に併行し，in vitroとin vivoの両実験系で供試するため，新潟県下の病院ならびに細菌検査機関からMRSAの臨床分離株を収集した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

国内外において，耐性菌が流布しつつも耐性菌の新規治療薬の開発が停止しているという問題に直面している．そこで，本研究では，DNAを素材とすることで ① 副反応の可能性が低く，② 配列の多様性と変更の簡便さに富み，③ 作用の新メカニズムと更新性が期待でき，④ 安価で安定な抗菌薬開発に挑戦することにした．研究初年度は，国内院内感染の約9割を占める薬剤耐性菌MRSAを対象に選び，且つMRSAの主要な耐性因子PBP2’に治療標的を絞る．DNA製の抗菌薬を作製し，in vitroとin vivoの両実験系で効果測定と副反応の検証を実施し，DNA製抗菌薬の構築サイクルを確立させる計画としている．研究実績の概要に記すように，臨床分離の薬剤耐性菌MRSA菌株を広く収集し，MRSAの耐性因子PBP2’を標的としたDNA断片ライブラリーの収集を推敲できている．また，結果観察のモデル確立として，p53機能阻害の系にて，一価陽イオン存在下で直鎖から立方体へ構造転換するDNA配列が，標的分子の構造障害を起こすことも確認した．

Strategy for Future Research Activity

計画二年目は，国内院内感染の第2位であるペニシリン耐性肺炎球菌や第3位の多剤耐性緑膿菌を必須標的とし，多様な耐性菌の耐性因子について DNA製抗菌薬の構築サイクルを循環させ，耐性因子とペアで特異的なDNA配列のデータを数多く集積する．そして，ディープラーニング解析により仮想的に新たなDNA製抗菌薬の構築を試みる．具体的な方法手順を以下に記す．
1. 初年度の手順に従い，肺炎球菌と緑膿菌の各種抗菌因子に結合するDNA配列をシークエンスし，追加データを新潟大学ビッグデータセンターにて蓄積する．2. ビッグデータセンターのGeForce並列計算システムで，薬剤耐性因子のアミノ酸配列とDNA製抗菌薬の配列相関をディープラーニングさせる．3. MRSAの耐性変遷は，申請者である寺尾が平成29年度までに遂行した科研費データから転送し，ディープラーニングで新規耐性菌の出現予測を試みる．そして，予測される耐性因子に結合するDNA配列をビッグデータ解析から推測する．
併行して，DNA製抗菌薬候補群に対し，収集したMRSA株および組換えPBP2’タンパク質を作用させ，Biacore解析を行う．DNA製抗菌薬候補群の中から，MRSAおよび組換えPBP2’と結合性の高い分子を選出する．順次，DNA製抗菌薬候補のMRSAに対する最小発育阻止濃度（MIC）を二段階希釈法で測定する．最後に，MICに優れたDNA製抗菌薬候補をMRSA感染マウスに投与し，生存率を観察する．併せて血液を採取し，血中の残存MRSA数をコロニー培養法で計測する．同時に，抗DNA抗体価はELISA解析し，サイトカインの増減はLuminex装置で多検体同時解析する．血液中の投与DNA残留については，シークエンスタグを利用してPCR検出する．

Causes of Carryover

交付申請時は，年度末開催の日本細菌学会総会での中間成果発表ならびに情報/資料収集を計画し，当該予算を見積もっていた．しかしながら，開催地である北海道地区に予測不可能な大規模地震が発生したため，日本細菌学会総会は，例年の年度末（2月もしくは3月）開催から，翌年度の2019年4月23~25日へと開催期間が変更となった．そのため，当初計画の年度内の旅費執行額が少なくなり，替わりに次年度使用額へと計画に変更が生じた．尚，本報告書を作成している2019年5月時点では，変更計画に従い，2019年4月23~25日開催の日本細菌学会総会での中間成果発表ならびに情報/資料収集を遂行し終えている．

Research Products

• [Journal Article] Antibacterial activity of hinokitiol against both antibiotic-resistant and -susceptible pathogenic bacteria predominant in the oral cavity and upper airways. (2019)
  • Author(s): Domon, H., Hiyoshi, T., Maekawa, T., Yonezawa, D., Tamura, H., Kawabata, S., Yanagihara, K., Kimura, O., Kunitomo, E., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aggregatibacter actinomycetemcomitans induces detachment and death of human gingival epithelial cells and fibroblasts via elastase release following leukotoxin-dependent neutrophil lysis. (2019)
  • Author(s): Hiyoshi, T., Domon, H., Maekawa, T., Nagai, K., Tamura, H., Takahashi, N., Yonezawa, D., Miyoshi, T., Yoshida, A., Tabeta, K., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The AmyI-1-18 peptide derived from rice inhibits alveolar bone resorption via suppression of inflammatory cytokine production induced by lipopolysaccharide and interleukin-1beta. (2019)
  • Author(s): Aoki-Nonaka, Y., Tabeta, K., Yokoji, M., Matsugishi, A., Matsuda, Y., Takahashi, N., Sulijaya, B., Domon, H., Terao, Y., Taniguchi, M., and Yamazaki, K.
  • Journal Title: J. Periodontol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antimicrobial susceptibility of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis clinical isolates from children with acute otitis media in Japan from 2014 to 2017. (2019)
  • Author(s): Nagai, K., Kimura, O., Domon, H., Maekawa, T., Yonezawa, D., and Terao, Y.
  • Journal Title: J. Infect. Chemother. Volume: 25(3) Pages: 229-232
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Peptides from rice endosperm protein restrain periodontal bone loss in mouse model of periodontitis. (2019)
  • Author(s): Tamura, H., Maekawa, T., Domon, H., Hiyoshi, T., Yonezawa, D., Nagai, K., Ochiai, A., Taniguchi, M., Tabeta, K., Maeda, T., and Terao, Y.
  • Journal Title: Arch. Oral Biol. Volume: 98 Pages: 132-139
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Repeated human deciduous tooth-derived dental pulp cell reprogramming factor transfection yields multipotent intermediate cells with enhanced iPS cell formation capability. (2019)
  • Author(s): Soda, M., Saitoh, I., Murakami, T., Inada, E., Iwase, Y., Noguchi, H., Shibasaki, S., Kurosawa, M., Sawami, T., Terunuma, M., Kubota, N., Terao, Y., Ohshima, H., Hayasaki, H., and Sato, M.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Pages: 1490
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Immunization with pneumococcal elongation factor Tu enhances serotype-independent protection against Streptococcus pneumoniae infection. (2018)
  • Author(s): Nagai, K., Domon, H., Maekawa, T., Hiyoshi, T., Tamura, H., Yonezawa, D., Habuka, R., Saitoh, A., and Terao, Y.
  • Journal Title: Vaccine Volume: 37 Pages: 160-168
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mechanism of macrolide-induced inhibition of pneumolysin release involves impairment of autolysin release in macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae. (2018)
  • Author(s): Domon, H., Maekawa, T., Yonezawa, D., Nagai, K., Oda, M., Yanagihara, K., and Terao, Y.
  • Journal Title: Antimicrob. Agents Chemother. Volume: 62(11) Pages: e00161-18
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Streptococcus pyogenes CAMP factor promotes calcium ion uptake in RAW264.7 cells. (2018)
  • Author(s): Kurosawa, M., Oda, M., Domon, H., Isono, T., Nakamura, Y., Saitoh, I., Hayasaki, H., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 62 Pages: 617-623
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neutrophil elastase subverts the immune response by cleaving toll-like receptors and cytokines in pneumococcal pneumonia. (2018)
  • Author(s): Domon, H., Nagai, K., Maekawa, T., Oda, M., Yonezawa, D., Takeda, W., Hiyoshi, T., Tamura, H., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Front. Immunol. Volume: Vol. 9 Pages: Article 732
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sulfated vizantin induces the formation of macrophage extracellular traps. (2018)
  • Author(s): Oda, M., Kurosawa, M., Yamamoto, H., Domon, H., Kimura, T., Isono, T., Maekawa, T., Hayashi, N., Yamada, N., Furue, Y., Kai, D., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microbiol. Immunol. Volume: 62 Pages: 310-316
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The effect of chlorhexidine on dental calculus formation: an in vitro study. (2018)
  • Author(s): Sakaue, Y., Takenaka, S., Ohsumi, T., Domon, H., Terao, Y., and Noiri, Y.
  • Journal Title: BMC Oral Health Volume: 18 Pages: 52
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Streptococcal cysteine protease-mediated cleavage of desmogleins is involved in the pathogenesis of cutaneous infection. (2018)
  • Author(s): Sumitomo, T., Mori, Y., Nakamura, Y., Honda-Ogawa, M., Nakagawa, S., Yamaguchi, M., Matsue, H., Terao, Y., Nakata, M., and Kawabata, S.
  • Journal Title: Front. Cell. Infect. Microbiol. Volume: Vol. 8 Pages: Article 10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pneumococcal DNA-binding proteins released through autolysis induce the production of proinflammatory cytokines via toll-like receptor 4. (2018)
  • Author(s): Nagai, K., Domon, H., Maekawa, T., Oda, M., Hiyoshi, T., Tamura, H., Yonezawa, D., Arai, Y., Yokoji, M., Tabeta, K., Habuka, R., Saitoh, A., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Cell. Immunol. Volume: 325 Pages: 14-22
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Streptococcus pyogenes CAMP factor promotes bacterial adhesion and invasion in pharyngeal epithelial cells without serum via PI3K/Akt signaling pathway. (2018)
  • Author(s): Kurosawa, M., Oda, M., Domon, H., Isono, T., Nakamura, Y., Saitoh, I., Hayasaki, H., Yamaguchi, M., Kawabata, S., and Terao, Y.
  • Journal Title: Microb. Infect. Volume: 20 Pages: 9-18
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Local regulator Del1 inhibits bone-resorption via suppression of Wnt5a-Ror2 signaling axis. (2018)
  • Author(s): Maekawa T, Domon H, Kobayashi K, Nagai K, Yonezawa D, Maeda T, Hajishengallis G, Terao Y.
  • Organizer: The ASBMR 2018 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 内因性抗炎症Del-1分子誘導による炎症性骨破壊の新規治療戦略 (2018)
  • Author(s): 前川知樹，土門久哲，田村 光，日吉 巧，寺尾 豊，前田健康
  • Organizer: 第61回秋季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] 口腔および上気道の病原細菌に対するヒノキチオールの抗菌作用解析 (2018)
  • Author(s): 土門久哲，國友栄治，寺尾 豊
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] 炎症および骨吸収の制御作用を有する新規食物由来ペプチドの検索 (2018)
  • Author(s): 田村 光，前川知樹，土門久哲，永井康介，日吉 巧，前田健康，寺尾 豊
  • Organizer: 第60回歯科基礎医学会学術大会
• [Presentation] Local regulator Del1 inhibits bone-resorption via suppression of Wnt5a-Ror2 signaling axis. (2018)
  • Author(s): Maekawa T, Domon H, Kobayashi K, Nagai K, Yonezawa D, Terao Y, Maeda T, Hajishengallis G.
  • Organizer: 96th General Session & Exhibition of the IADR
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 内因性抗炎症分子Del-1分子誘導による炎症性骨破壊の新規治療戦略 (2018)
  • Author(s): 前川知樹，小林泰浩，土門久哲，田村 光，日吉 巧，永井康介，寺尾 豊，前田健康
  • Organizer: 第4回日本骨免疫学会
• [Presentation] 食物由来ペプチドを用いた炎症と骨吸収の制御法の検索 (2018)
  • Author(s): 田村 光，前川知樹，米沢大輔，土門久哲，永井康介，日吉 巧，多部田康一，前田健康，寺尾 豊，吉江弘正
  • Organizer: 第61回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] Aggregatibacter actinomycetemcomitansによる歯周組織破壊メカニズムの解析 (2018)
  • Author(s): 日吉 巧，土門久哲，永井康介，前川知樹，高橋直紀，米沢大輔，田村 光，吉田明弘，寺尾 豊，吉江弘正
  • Organizer: 第61回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] 肺炎球菌性肺炎の重症化メカニズムの解析－新規肺炎制御法への展開－ (2018)
  • Author(s): 土門久哲，永井康介，前川知樹，山口雅也，川端重忠，寺尾 豊
  • Organizer: 第6回五大学・口腔微生物研究会
• [Presentation] Aggregatibacter actinomycetemcomitansが産生するロイコトキシンによる歯周組織破壊メカニズムの解析 (2018)
  • Author(s): 日吉巧，土門久哲，永井康介，前川知樹，高橋直紀，米澤大輔，田村光，吉田明弘，寺尾 豊
  • Organizer: 第6回五大学・口腔微生物研究会
• [Presentation] 肺炎球菌とマクロライド：新潟市内の耐性菌分離率と病原性抑制作用の解析 (2018)
  • Author(s): 土門久哲，前川知樹，永井康介，栁原克紀，木村 征，寺尾 豊
  • Organizer: 第57回新潟化学療法研究会学術講演会
• [Presentation] マクロライド耐性肺炎球菌に対するマクロライド系抗菌薬の作用解析 (2018)
  • Author(s): 土門久哲，前川知樹，永井康介，栁原克紀，木村 征，寺尾 豊
  • Organizer: 第25回マクロライド新作用研究会
• [Presentation] 内因性抗炎症分子Del-1を介したマクロライド系抗菌薬の新作用機序 (2018)
  • Author(s): 前川知樹，土門久哲，寺尾 豊
  • Organizer: 第25回マクロライド新作用研究会
• [Book] 日本歯科評論：米ペプチドを用いた歯槽骨吸収の抑制 (2019)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 190
  • Publisher: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [Book] 日本歯科評論：誤嚥性肺炎の分子制御に向けて (2019)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 182
  • Publisher: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [Book] 日本歯科評論：歯周病における歯肉細胞損傷メカニズムとその制御研究 (2019)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 印刷中
  • Publisher: ヒョーロン・パブリッシャーズ社
• [Book] パーフェクトマスター口腔微生物学・免疫学 (2018)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 93
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Book] 微生物学，歯科衛生士 歯科衛生士書き込み式学習ノート① (2018)
  • Author(s): 寺尾 豊
  • Total Pages: 298
  • Publisher: 医歯薬出版