Research for abnormal cellular signaling in fibrous dysplasia and its drug discovery

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K19642
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 豊澤 悟 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (30243249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鵜澤 成一 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (30345285) ; 阿部 真土 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (40448105) ; 宇佐美 悠 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (80444579)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2021-03-31
• Keywords: GNAS遺伝子変異 / 線維性骨異形成症 / 骨髄間質細胞 / 細胞内シグナル伝達異常 / 細胞内cAMP

Outline of Annual Research Achievements

線維性骨異形成症(FD)は、GNAS遺伝子の変異によるシグナル伝達異常が骨髄間質幹細胞等の間葉系幹細胞系譜に起こって発症する骨疾患である。本研究では、FDの病態解明と創薬に有効なFDモデルマウスを作製するため、Creマウスと交配させると、目的細胞にGNAS遺伝子変異によるシグナル伝達異常を起こすGNAS変異Floxマウスを作製した。
まず、目的細胞にGNAS遺伝子変異によるGsα変異体(GsαR201H)を発現させるため、Gsαのコドン201番のArgをHisに置換する変異GNAS遺伝子のマウス相同遺伝子を用いて、Gt(ROSA)26Sor遺伝子座のExon1とExon2の間に標的遺伝子をノックインするようRosa-Stop fl/fl-GsαR201Hマウスのベクターを設計した。そのターゲティングベクターを構築し、相同組換えES細胞樹立を行った。次に、c57BL/6J系統マウス由来のES細胞に目的遺伝子を挿入した相同組換えES細胞を、Balb/C系統マウス由来の胚へマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。ES 細胞由来の細胞が50%と70%となるキメラ寄与率の高い２匹のF0ヘテロマウスを得た後、キメラ寄与率70%のF0マウスとの交配により、目的遺伝子がgermlineに挿入されたF1ヘテロマウスを得た。Neomycin配列とFLP配列を除去して、GNAS変異Floxマウスを作製した。
GNAS変異Floxマウスを用いて、目的細胞にGsα変異体発現の作用があることを確認するため、骨細胞にCreが発現するDmp1-Creマウスと交配させた所、骨量の増加が認められた。続いて、FDモデルマウスを作製するため、骨髄間質細胞にGsα変異体を発現するようにGNAS変異FloxマウスをLeptin Receptor(Lep)-Creマウスと交配させて、現在、骨格変化を解析中である。