2019 Fiscal Year Research-status Report
ノロウイルス流行予測のための、下水からノロウイルスを選択的に濃縮する技術の開発
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18K19676
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
井原 賢 京都大学, 工学研究科, 特定助教 (70450202)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | ノロウイルス / 下水 / 免疫沈降 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度の研究では、食品でのノロウイルス分析法として公定法になっているパンソルビントラップ法を参考にして、ヒト免疫グロブリン製剤を用いたIP-qPCRを流入下水に適用した。GII-ノロウイルス(GII-NoV）とトウガラシ微斑ウイルス(PMMoV)を定量した結果、そして、従来のqPCRと比較したところ，IP-qPCRのGII-NoVの検出濃度は従来qPCRの2～5%であった。この結果から、GII-NoV及びPMMoVに対して抗体濃縮が有効であると示唆された。
この結果を受けて、今年度は、培養可能なウイルスを用いてのIP-qPCRの検討を行った。具体的にはバクてリオファージMS2を用いて検討を行った。培養可能なMS2で免疫沈降できれば、下水からのウイルス回収の最適化に向けて様々な条件を実験を繰り返すことで検討できるために、この実験を計画した。
実験では、事前に培養して増やしたMS2を遠沈管にとりわけ、抗MS2抗体とプロテインGセファロースビーズを添加して、室温で反応させたのちに、遠心によってビーズを回収した。そして、回収したビーズからウイルスRNAを抽出し、逆転写を行い、qPCRに供した。免疫沈降前のMS2濃度と免疫沈降後のqPCRによる濃度測定を比較することで、抗体によってMS2がどれくらい回収できるかを把握することとした。結果は、残念ながら、MS2は抗MS2抗体で沈降しない結果となった。抗体との反応条件に検討の余地があるが、根本の原因は市販の抗MS2抗体の相互作用が免疫沈降に耐えうるだけ十分に強くない可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
下水からのノロウイルスの免疫沈降を検討する前に、予備試験として、バクテリオファージMS2で免疫沈降が可能かどうかを検討したが、残念ながら、MS2は免疫沈降できなかった。
そもそも抗MS2抗体の性能が十分でなかった可能性が考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ヒト免疫グロブリン製剤を用いたIP-qPCRを下水試料への適用に対して、ノロウイルスを効果的に回収するための検討を行う。具体的にはヒト免疫グロブリン製剤と磁気ビーズを活用して反応条件を検討する。下水中の有機物や粒子状物質から可能なかぎりノロウイルスを精製するための、洗浄条件も検討を行う。
また、磁気ビーズの他に、カラムを用いてのアフィニティー精製も検討を行う。
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| Causes of Carryover |
バクテリオファージMS2の免疫沈降の基礎検討におもに取り組んだため、消耗品費が想定よりも少なくなった。次年度はノロウイルスの免疫沈降の条件検討を行い、PCRによる検証およびスケールアップのためのカラム濃縮での条件検討を行う。さらに、ノロウイルス培養系での感染性ノロウイルスの濃縮の可否を検討する。以上の計画に助成金を使用する計画である。
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