2018 Fiscal Year Research-status Report

Development of innovative method to evaluate tissue aging

Research Project

Project/Area Number	18K19754
Research Institution	University of Shizuoka
Principal Investigator	伊吹裕子静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (30236781)
Project Period (FY)	2018-06-29 – 2021-03-31
Keywords	老化 / 熱 / γ-H2AX / アクチン / DNA損傷
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、組織の老化について、熱処理による細胞骨格の崩壊やDNA切断を指標に評価する系を構築することを目的としている。本年度は、１．年齢の異なるヒト皮膚細胞の培養、２．ヒト皮膚細胞でヒストンH2AXリン酸化（γ-H2AX）を生成させる熱処理条件の検討、３．マウスを使用した実験を行うためのリンパ球培養細胞を用いた熱処理条件の検討を行った。１．年齢の異なるヒト皮膚細胞の培養：ヒト皮膚細胞ASF-4-1はPDL(Population doubling level)が34のものを購入し培養した。PDLが57になると細胞が老化し増殖しなくなったので、PDL40程度の細胞と、PDL50～55程度の老化した細胞を使用し、今後の比較実験を行うことにした。２．ヒト皮膚細胞でγ-H2AXを生成させる熱処理条件の検討：ASF-4-1細胞に熱を38-43℃、30分間暴露し、γ-H2AXの生成をウエスタンブロッティングで検出した。40-42℃でγ-H2AXの誘導が強く認められたので、今後、41℃を使用して、年齢の違いによる反応を検討する予定である。３．リンパ球培養細胞を用いた予備的検討：老化したマウスを使用して、今後実験を進める予定であるが、採取する組織は、最も簡便に採取できる血液細胞が第一候補となる。そこで、血液細胞における検討の可否について、ヒト前骨髄性白血病細胞であるHL-60における熱作用後のγ-H2AXの生成を検討した。HL-60細胞では、41-44℃で顕著なγ-H2AXの誘導が認められた。以上の結果から、次年度は年齢の異なるヒト皮膚細胞でのγ-H2AX誘導の違い、それに細胞骨格アクチンの崩壊がどのように関わっているのかを解析する。また、３．の結果から、リンパ球でも熱作用後のγ-H2AXの生成を検出することが可能であることが示唆され、次年度はin vivo実験を進めていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 年齢の異なる細胞の準備、熱処理条件の決定などは予定通り進んだ。当初の予定では、始めに老化によるアクチンの量を検討することにしていたが、次年度行うこととして、先に、in vivoの実験を見据えて、リンパ球細胞を用いた熱処理条件の設定などの予備実験を行った。
Strategy for Future Research Activity	各PDLで液体窒素保存が完了したヒト皮膚細胞ASF-4-1を用いて、γ-H2AX生成の老化による差異、そのメカニズムについて検討を行う。特に、老化によるアクチン骨格の変化とDNase Iの遊離との関連に焦点をあて解析していく。平行してin vivoの実験を進める。既に、リンパ球でも熱作用後のγ-H2AXの生成を検出することが可能であることが示唆されているので、マウス血液、脾臓リンパ球を使用して検討を行っていく。