Development of methodology for monitoring DNA repair process in living cells using a super-resolution microscope

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K19848
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 中村 麻子 茨城大学, 理工学研究科(理学野), 教授 (70609601)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2021-03-31
• Keywords: DNA損傷 / H2AX / 超解像度顕微鏡 / リアルタイムイメージング

Outline of Annual Research Achievements

本研究計画では、従来、細胞を固定しなくては検出できなかった修飾型タンパク質の細胞内局在をリアルタイムにイメージングできる方法を開発することを目的としている。特に本研究では、DNA損傷応答に重要なタンパク質であるリン酸化型ヒストンH2AX（γ-H2AX）に着目し、DNA損傷の発生とその修復過程のリアルタイムイメージングを最終目的として、γ-H2AXのリアルタイムイメージング標識、超解像度広視野レーザー位相差顕微鏡の開発を目指す。2020年度は以下に掲げる研究項目を実施し成果を得た。
【超解像度顕微鏡の開発およびリン酸化型H2AX抗体の金コロイド標識】
研究協力者である高度技術研究所の清水グループが開発した超解像度広視野レーザー位相差顕微鏡は、 80nmの微粒子や口腔上皮細胞の核内構造を観察できるほどの超解像度を有する顕微鏡である。今年度はレーザーの安定性や、より微小な構造を解析できるように顕微鏡の改良を行うとともに、これまで位相差での細胞形態の観察に限られていたが、DNA損傷応答に対する様々なタンパク質のリアルタイムな挙動を解析するため、本年度はレーザーによるDNA損傷誘発を可能にするようなレーザーの改良を行った。また、昨年度に引き続きリン酸化型H2AXのリアルタイムイメージングを行うために、80nm径の金コロイド粒子によってγ-H2AXに対する抗体を標識することでγ-H2AXをリアルタイムにイメージングできるか検討を行った。今年度はパッケージングの条件を変更するなどして、導入効率の向上を目指した。導入後の細胞に対し薬剤を用いてDNA損傷を誘発し、γ-H2AXに対する免疫染色を行い導入効率およびγ-H2AXの局在変化を検討した。その結果、一部の金コロイド標識抗体の導入は見られたがリアルタイム解析をするに十分な導入効率は認められなかった。