2018 Fiscal Year Research-status Report
嫌気的自然環境で起こる有機汚染物質の脱塩素化反応を好気条件下で実現させる
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18K19881
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高塚 由美子 京都大学, エネルギー理工学研究所, 特定准教授 (70570810)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原 富次郎 京都大学, エネルギー理工学研究所, 特定教授 (70616193)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | ポリ塩化ビフェニル / 還元的脱塩素化酵素 / 遺伝子組換え細菌 / ビタミンB12 / Dehalococcoides |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポリ塩化ビフェニル類（PCBs）は難分解性の環境汚染物質で、土壌河川等の有効な浄化法は未だ無く、PCBs廃絶は持続可能な社会形成に極めて喫緊な課題として国際的に認識されている。自然界でのPCBs微生物分解には「好気下での酸化的ビフェニル環開裂」と、反応条件が厳しく実用的利用が困難とされる「嫌気下での還元的脱塩素化」が知られる。本研究は、高塩素置換型PCBsの還元的脱塩素化分解を大気下で実現させる、世界初の革新的な生物触媒の創出を目的とする。
偏性嫌気性細菌のPCBs還元的脱塩素酵素（Wangら、2014）は、ビタミンB12を補酵素として1価コバルトが活性種となり触媒反応するが、コバルト再生に高い還元力が要るため大気下で活性を維持できない。我々は、PCBs脱塩素酵素に1価コバルトを安定的に再生する特性を付与することを目標に、当該年度は本酵素を発現する遺伝子組換え細菌の作製を試みた。
我々は以前に、デハロコッコイデス属細菌の公開ゲノム情報を基にPCBs脱塩素酵素２種類を選抜し、酵素活性に必須と推測した細胞膜結合アンカータンパク質を共発現する人工遺伝子を作製して、大腸菌を宿主とした組換え酵素の発現に成功したものの、活性は検出できなかった。そこで今回は、宿主としてビタミン高生産株で好気と嫌気の両条件下で生育可能な大腸菌近縁の腸内細菌（A株とする）の使用を検討した。本菌株が数種類の抗生物質に自然耐性を示したためプラスミド選択マーカー遺伝子を変更し、lacプロモーター制御下の発現系を再構築したが、嫌気・好気いずれの条件下でも組換え酵素の発現を確認できなかった。そこで、tacプロモーター制御下の新たな発現ベクターを構築してA株に導入した結果、２種類のうち１種類について目的タンパク質の発現を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度に実施計画していた「PCBs脱塩素酵素を発現する遺伝子組換え細菌の作製」は、デハロコッコイデス属細菌由来の組換え酵素について、ビタミン高生産細菌のA株を宿主とした酵素タンパク質発現系の構築に成功することで達成できた。
実験経過において、A株が数種類の抗生物質に対して自然耐性を示したことや、発現酵素タンパク質を検出できなかったことなどから、発現ベクターを構築し直す必要があったが、最終的にはtacプロモーター制御下で発現誘導可能な遺伝子組換え細菌を作製することができた。選抜した２種類のPCBs脱塩素酵素のうち、１種類についてはまだ酵素タンパク質の十分な発現量を確認できていないため、引き続き検討を行う予定である。
当該年度に作製成功したPCBs脱塩素酵素タンパク質を発現する本遺伝子組換え菌株を用いて、次年度は当初の予定通り、PCBsに対する脱塩素化活性の確認を行っていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度において、PCBs脱塩素酵素タンパク質を発現する組換え細菌株の作製に成功した。よって次年度以降は、（１）組換え酵素が嫌気下で高塩素置換型PCBsを脱塩素化することを確認した後、さらに（２）その組換え酵素に1価コバルトを安定再生できる特性を付与した新しい機能性酵素を創生し、好気下でも高塩素化PCBsを脱塩素化することを確認する。
（１）組換え酵素による高塩素置換型PCBsの脱塩素化反応
組換え細菌株が、嫌気下で高塩素化PCBsに対し脱塩素化活性を示すことを確認する。高塩素化PCBsには市販PCBs及び同族体単体の標準品を使用し、特に生体毒性の高いコプラナーPCBsや、PCBs酸化的環開裂分解の初発酵素ビフェニルジオキシゲナーゼが作用しないPCB同族体の脱塩素化に注目する。本実験はグローブボックス内で行い、反応系にはチタン(III)－クエン酸錯体を添加した還元下で行う(Zehnderら、1976)。
（２）コバルトを安定再生できる特性を付与した新機能酵素の創生
本特性を付与するにあたって、組換え酵素の活性中心付近に低分子化合物を導入するため、マレイミド結合型蛍光プローブ導入に代表される、タンパク質の部位特異的ラベル化方法を利用する(Takatsukaら、2010)。組換え酵素の活性中心付近へチオール基やアミノ基等を持つラベル可能なアミノ酸残基を導入し、反応基を導入した低分子化合物を結合させる。この新機能性酵素で、好気下でのPCBs脱塩素化反応を試みる。
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| Causes of Carryover |
当初、遺伝子組換え細菌作製の宿主菌株として、上手く機能しなかった場合を考慮し複数菌種を予定していたが、第一候補菌株での作製に成功したため菌株購入費を使用せずに済んだ。次年度は、組換え酵素のPCBs脱塩素化活性の確認のために、PCB分析費用がより必要となるため、生じた次年度使用額はPCB分析費用として使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
