2019 Fiscal Year Research-status Report

Mechanism of spread of Rice Orange Leaf Phytoplasma in Southeast Asia

Research Project

Project/Area Number	18KK0171
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	千葉壮太郎名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (70754521)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中利治名古屋大学, 生命農学研究科, 特任教授 (30227152) 大井崇生名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (60752219) 佐藤育男名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (70743102)
Project Period (FY)	2018-10-09 – 2022-03-31
Keywords	イネオレンジ葉ファイトプラズマ / 発生分布 / 拡散メカニズム
Outline of Annual Research Achievements	ファイトプラズマは農業上重要な絶対寄生病原菌のグループであり、人工的に培養できないため病原／伝播性機構について分子レベルで解明された例は殆どない。地球温暖化と気候変動による寒冷感受性昆虫の活動地域が広がるにつれて、熱帯・亜熱帯地域で発生するファイトプラズマ関連病害が今後北上すると考えられる。本研究では、イネオレンジ葉ファイトプラズマ（ROLP）の発生状況を把握するために、東南アジア諸国の広域に渡って調査を実施する。合わせて分子系統学的解析を行ない、 ROLPの起源を初めて明らかにするとともに、感染域拡大のメカニズムに迫る。 2018-2019年度は、研究拠点と据えているカンボジアとフィリピンにおいて、ROLPの発生調査を進め、定期的に発病イネサンプルを採取し、飼育した昆虫による病原伝搬試験を実施した。その結果、既報の媒介昆虫種に加えて、新規媒介昆虫種の同定に成功した。また、タイでは同研究を進めていた研究者とコンタクトを取ることができ、ROLPの多様性にまつわる情報を得た。さらに、全ファイトプラズマを検出可能なLAMP法を適用したところ、各地由来のROLPの検出が可能であった。カンボジア、タイ、フィリピン、ベトナム産ROLPの遺伝的多様性が明らかにされた。さらに、既報の中国株のゲノム情報を基に、ROLP特異的なLAMP検出法を試用中であり、今後、東南アジア諸国において圃場でのオンサイト発生調査に利用する予定である。急速に感染拡大するROLPの伝搬能力について、その一端を明らかにするため、感染イネ組織におけるROLPの挙動を顕鏡的に調査した。DAPI染色により師部組織特異的な蛍光集積を頼りにROLPの簡易的観察が可能となったため、組織毎に感染挙動を観察可能となった。また、同組織を走査型電子顕微鏡（SEM）で観察した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ゲノム／RNAseq解析：遅延：カンボジアで採取したDNAおよびRNAサンプルの品質が低くゲノム解析等が遅延している。対策を検討中である。多様性解析／発生調査：やや遅延：カンボジア、フィリピン、ベトナムにおけるPCRによるROLPの発生調査により、複数の遺伝子断片を取得しており、これらと他の機関からの配列情報によって遺伝的多様性を明らかにした。国際イネ研究所（IRRI，ロックダウン中）に保管中のサンプル解析を待って、論文化する。台湾での実施調査は実行に至らず、次年度での協力依頼に止まった。タイでは現地国内誌で公表されたデータについて議論する事が叶った。試用中のLAMP法を用いての実地調査が未実行であり、多様性に堪えるか確認を要する。渡航自粛により、遅延が発生している。伝搬解析：順調に推移：媒介昆虫による伝搬試験では、既知のベクターによる伝染を確認し、さらに新たに他の昆虫種の伝搬能も認められており、既知ベクターに比較して低率でROLPを伝搬した（フィリピン拠点）。興味深いことに、これは現地のイネ圃場で多発生している種であり、ROLP感染拡大の一因となっている可能性が示唆された。他の保毒昆虫の伝搬能力については未確認である。組織学的解析：順調に推移：植物体内において、ROLPが師部組織に集積することは、DAPI染色法と蛍光顕微鏡観察で確認された（カンボジア拠点）。イネの各組織で同法によるROLP集積とタイミングについて調査中だが、カンボジア拠点における虫媒接種効率が悪く、昆虫と植物の生育環境を最適化する必要がある。またSEMで病状の進んだイネ組織片を観察したところ、組織非特異的に過剰なスターチの蓄積が観察された。さらに、師部組織においてはROLPと思われる多量の顆粒状の物体が観察されたが、通常より明らかに小さいサイズであるため、固定法を含めて検証が必要である。
Strategy for Future Research Activity	全体：COVID19による社会的な影響を注視しながら、実施可能な項目について進めていく。幸い、カンボジアとフィリピンの拠点にはコアとなる共同研究者が居ることから、両拠点における共同研究を主軸にオンラインベースで研究を進めることができると考えている。ゲノム／RNAseq解析：ROLPによってダメージを受けた植物サンプルのDNAは品質が悪い。このようなサンプルから、ファイトプラズマのDNAを選択的に精製（メチル化DNA精製キット）し、次世代シーケンサーに供し、完全長ゲノムの決定を試みる。同サンプルのRNAはさらに品質が悪く、RNAseqには使用できない。伝搬試験サンプルの使用を検討する。多様性解析／発生調査：渡航制限の解除に加えて、安全に研究活動を行なえる環境が整い次第、東南アジア各国での実地調査を再開する。オプションとして、既にコンタクトのあるインドネシア、ミャンマー、バングラディシュの各協力研究者に発生調査と遺伝子解析を委託する選択肢もある。この場合、LAMP法を適用することは叶わないが、基本的情報収集が可能である。伝搬解析：研究室内において、継続的に虫媒伝搬を繰り返すことでROLPの維持体制の確立を目指す（カンボジア拠点）。本システムを利用し、昆虫が保毒するまでの吸汁時間や伝搬可能な期間等を明らかにしたい。また、保毒昆虫は他の種も認められていることから、これらの伝搬試験も実施する計画をしている。組織学的解析：カンボジア或いはフィリピン拠点において、継続的虫媒伝搬によるROLPの研究室内維持が可能になり次第、大井が現地で植物および昆虫の切片作成を行ない、電子顕微鏡観察を集中的に行う。本項目は余人を以って代えがたいため、渡航計画が立ったタイミングで実施する。DAPI染色による植物組織の簡易観察はカンボジア拠点において担当者が進める。また、媒介昆虫の同法による観察も試す。
Causes of Carryover	遺伝子解析費：サンプルの精製度に問題があり、PCR産物の配列解析のみを執行し、次世代シーケンサーの外注費を執行していない。条件が整い次第、実施する予定である。旅費：渡航自粛により、台湾およびインドネシアでの調査を延期した。また、研究開始当初から千葉・田中・佐藤のカンボジア、タイ、フィリピンへの渡航が他用務の出張（名古屋大学アジアサテライトキャンパス学院・国家中枢人材養成プログラムなど）に合わせて行なえたことから、旅費を大幅に抑えられていることを申し添えたい。したがって、計画時の対象以外の国への調査も可能になると考える。さらに、渡航が継続的に困難になった場合には、推進方策に記した通り、協力研究者への業務委託費として執行する可能性も考慮している。