2019 Fiscal Year Research-status Report
生体分子中の窒素の特性を，中性子回折と計算化学により解明する
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18KK0194
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (80380525)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 徹 広島市立大学, 情報科学研究科, 講師 (80747494)
塚本 卓 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (30744271)
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| Project Period (FY) |
2019-02-07 – 2022-03-31
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| Keywords | 結晶成長 / 中性子線回折 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ブロックポリマーを用いたキャピラリー内結晶成長法を幅広い対象に適用するため，示差走査型熱量計による解析を進めた。本研究は，蛋白質分子を対象とした生命科学であるが，合成ポリマーやレオロジー，結晶成長理論の専門家等，幅広い学際研究である。そのため解析の結果は，学際的な研究会での発表内容となった。また，ブロックポリマーの官能基，重合度が及ぼす影響を調べるため，合成ポリマーの専門家である共同研究者，韓国浦項工科大学校のKim博士の研究室に滞在して，ポリマーの合成や物性の評価をおこなった。また，Kim博士が合成した１５種類のポリマーの提供を受けた。グルタミン依存型アミドトランスフェラーゼ(Gat)CAB複合体だけでなく，脱アミノ化酵素やプロトンチャネルに関して，結晶成長法を評価した。アンモニアチャネルに関しては，組換え発現系を構築して良好な蛋白質発現が確認できている。塚本はイミンにおける水素の挙動を中性子線・X線解析で理解するための蛋白質を精製し，10 x 10 x 10 um^ 3の結晶を得たが，X線回折能は8オングストローム程度である。類似する膜蛋白質の物性評価をおこなって，生物物理学会でポスター発表した（関連６題）。また，窒素に結合した水素の挙動を追跡するためには，QM/MM-MD法を適用した計算が必要であるが，齋藤は量子化学計算法rPM6やドッキングシミュレーションを用いたタンパク質-リガンド結合部位予測の研究を行い，生体分子科学討論会やSymposium on Electronic Structure and Dynamics of Complex Systems（招待講演）等で発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GatCABの中性子線回折測定のために，ミュンヘン工科大学の実験原子炉MLZ (FRM II)のビームタイム使用のための課題は採用されているが，稼働用燃料輸送の問題により長期にわたり（2019年冬まで）運転停止であったため，既存のデータである回折分解能3.0オングストローム以上のデータ収集を行うことができていない。その間，他の蛋白質として，脱アミノ化酵素の発現・精製・結晶成長系の構築や，アンモニアチャネルの発現系，プロトンチャネルの初期結晶調製系を構築した。また，示差走査型熱量計による解析により得られた初期結晶化条件と，手持ちの添加剤との組合せにより，結晶成長が見込めるかどうかを判定する方法を開発中である。
膜蛋白質に対して，開発中の結晶成長方法が適用可能かどうかを調べるため，光受容体タンパク質に関しても，調製系を最適化し，結晶成長の条件検討をおこなっている。
開発してきた高速な量子化学計算法rPM6やドッキングシミュレーションを用いて、タンパク質-リガンド結合部位予測をおこなった（対象蛋白質: CYP3A4，CYP2D6）。結合部位周辺の空間が広いCYP3A4に関しては，rPM6から算出されたリガンドの結合解離エネルギーのみを用いて結合部位を予測できることを示した。また、rPM6を用いた量子古典混合分子動力学（QM/MM MD）計算を実行可能とするために、分子動力学計算プログラムNAMD内のpythonスクリプトの改良を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
脱アミノ化酵素はある程度結晶成長が見込めるため（現在のところ，一辺0.5 mm），東海村J-PARCにある蛋白質中性子回折計で回折能の評価をおこない，構造解析する。脱アミノ化酵素では生成物としてのアンモニア存在下によって解析するため，基質ソーキングを試みる。クライオ条件によって測定することも考え得るため，研究室のX線回折計によって条件検討をおこなう。アミド基転移酵素GatCABはドイツMLZが使用できるようになりしだい，分解能の高いデータ収集を目指す。ミュンヘン工科大学に長期滞在できるようになれば，キャピラリー内で成長させた結晶の測定タイミングをX線と中性子で判断できる。また，浦項工科大学にさらに長期滞在することにより，膜蛋白質も含め，より系統立てて結晶成長の可能性を判断する方法を完成させる。その際，添加剤の官能基を少しだけ変えたものを使用し，該当結晶成長条件における物性や，結晶成長における影響を観測する。
齋藤は，これまでに開発したシミュレーションの基盤技術を活用し，QM/MM-MD計算によるプロトン化状態の予測に着手する。デュイスブルク-エッセン大学に滞在し，自由エネルギー曲面を効率的に得るための計算技術を習得するとともに，スーパーコンピューターで長時間のQM/MM-MD計算を実施する。
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| Causes of Carryover |
ミュンヘン工科大学の実験原子炉MLZ (FRM II)の稼働用燃料輸送の問題により長期にわたり（2019年冬まで）運転停止であったため，ミュンヘン工科大学にて予定していた研究が遂行できていない。また，Duisburg-Essen大学で予定していた， QM/MM-MD計算は，新型コロナウイルスによる研究室閉鎖のため，おこなえていない。両者の研究に関し，新型コロナウイルスの感染流行が収束した後に，渡航研究をおこなう。
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