2019 Fiscal Year Research-status Report
Mechanical manipulation and in vitro reconstitution of microtubule severing
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18KK0195
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
中村 匡良 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 特任講師 (40553409)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉成 晃 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 研究員 (00829872)
橋本 隆 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (80180826)
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| Project Period (FY) |
2018-10-09 – 2022-03-31
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| Keywords | 微小管 / 細胞骨格 / カタニン / チューブリン / 植物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小管の配向パターン形成の制御は、染色体分離や細胞極性、形態形成など生物に必須な活動に寄与している。発生や環境シグナルに応答し植物が表層微小管の変化させるためには、カタニンによる微小管切断が重要である。微小管動態解析により植物体表面の間期表皮細胞における微小管切断部位や切断に要する時間は確認できるが、カタニンの局在性や切断活性制御の分子基盤は明らかとなっていない。そこで、本研究では、従来の遺伝学や生化学的解析に加え、ライブセルイメージング法やin vitro再構築系の確立を行うことで微小管切断装置を分子レベル・細胞レベルで理解することを目的とする。微小管切断因子であるカタニンは切断活性を持つp60サブユニット、及び切断部位や活性を制御するp80サブユニットで構成される。表層微小管の時間的空間的な制御機構を明らかにするため、p80および関連タンパク質のカタニン局在への機能を調べる。カタニンp80サブユニットはシロイヌナズナゲノム上に４つ確認されている。計画２年目はこれまでのp80-2に加えてp80-1を中心にin vitro再構成系のための微小管切断タンパク質発現用ベクターの作製と発現精製、ライブセルイメージング用の植物体の作製を行った。赤色蛍光タンパク質mCherryを付加したチューブリンタンパク質を発現する植物体と交配し、局在解析を行った。その結果、シロイヌナズナにおいてC末に緑色蛍光タンパク質GFP を付加したp80-1GFPが微小管形成部位と微小管交差部位に局在し、p80-2やp60と同様に微小管切断に関わることが示唆された。また、in vitroの光ピンセット実験で微小管を交差させることに成功した。現在、in vitroに用いるp60サブユニットとp80サブユニットのタンパク質の準備を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
微小管切断因子であるカタニンは切断活性を持つp60サブユニット、及び切断部位や活性を制御するp80サブユニットで構成される。分子レベルでの詳細な機構を調べるため、動的な微小管をin vitroで再構成し交差部位でのp80および関連タンパク質のカタニン局在への機能を調べる。光ピンセットを用いin vitroで2本の微小管を交差させた。シロイヌナズナのそれぞれのサブユニットを昆虫培養細胞で発現し精製を行なった。また、シロイヌナズナには４つのp80が存在し、これまで注目していたp80-2に加えてp80-1の生体内での局在解析を行った。p80-1もp80-2同様に微小管切断に関わることが示唆された。さらに、詳細な動態解析からp80-2の微小管マイナス端への局在が確認され、マイナス端制御への機能が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
動的微小管を用いたin vitro再構成系の確立を行い、これまでに得られた微小管切断タンパク質p60サブユニット・p80サブユニットの微小管交差部位でのカタニン局在性への機能を調べる。また一般的にin vitroの系で使用されるブタのチューブリンに加え、植物から精製したチューブリンを用いた実験を行う。細胞層特異的なカタニンのマーカーラインを作製する。
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| Causes of Carryover |
研究遂行に係る旅費についての支出額は予定していた研究打ち合わせや実験の都合上、回数が減少した。また物品費の差額については一部の実験を次年度へ延期したために生じた。そこで研究代表者と分担者は次年度において研究計画で示した実験とともに延期した一部の実験や解析を追加して行う。
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Research Products
(2 results)
