2018 Fiscal Year Research-status Report

live-cell hybrid imaging of morphological dynamics of the plasma membrane

Research Project

Project/Area Number	18KK0196
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	吉村成弘京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90346106)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	粂田昌宏京都大学, 生命科学研究科, 助教 (00582181) 吉田藍子北海道大学, 医学研究院, 特別研究員(PD) (70831288) パウデルサラド北海道大学, 医学研究院, 助教 (30793939) 植村知博お茶の水女子大学, 理系女性教育開発共同機構, 准教授 (90415092)
Project Period (FY)	2018-10-09 – 2022-03-31
Keywords	ライブセルイメージング / 高速原子間力顕微鏡 / 超解像顕微鏡 / エンドサイトーシス
Outline of Annual Research Achievements	2018年度の研究は、基本的には計画通りに遂行し、主にフェーズ１（高速原子間力顕微鏡と超解像蛍光顕微鏡との融合）の内容に取り組んだ。このフェーズでは、主に京都大学と欧州分子生物学研究所が共同し、高速原子間力顕微鏡技術と超解像顕微鏡技術との融合を目指す。欧州分子生物学研究所のグループでは、各種超解像顕微鏡(PALM/STORM)を自作してきた実績があり、この技術と京都大学で有する高速原子間力顕微鏡技術とを融合するためのシステムの検討・実験をおこなう。本年度における各研究項目の成果は以下の通りである。項目i) 高速原子間力顕微鏡と超解像顕微鏡との両立を可能にする光学系の設計・構築および高速化)：高速原子間力顕微鏡のスキャナユニットがステージ上部を占領するため、これと空間的に干渉しない光学系の作成法や、超解像顕微鏡の高速化に取り組んだ。高速原子間力顕微鏡が搭載されている倒立型顕微鏡のサイドポートを利用して、超解像の光学系を導入する可能性を、メールおよびSkypeによる意見交換と議論を行った。項目ii) (時空間的相関イメージングを可能にする制御系の検討・構築)に関しては、現有の高速原子間力顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡とを組み合わせた相関イメージングシステムに関して、空間的位置合わせ法の確立を目指して実験を行った。クラスリンの蛍光輝点と原子間力顕微鏡での凹みとのとの位置合わせを行ったところ、ライブセル観察では20nm程度、固定した細胞では最大10nm程度の位置ずれを検出した。これは、超解像顕微鏡の空間分解能以上の誤差であり、今後の改善が必要である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2018年度は概ね計画通りに進展した。10月からの半年間、主にフェーズ1に取り組み、高速原子間力顕微鏡と超解像顕微鏡との融合に必要なシステムの要件に関して、議論を重ねた。特に超解像顕微鏡の光学系を高速原子間力顕微鏡システムに組み込む点に関しては、複数の可能性を検討し、その妥当性を今後検証することで同意した。これにより、当初予定していた欧州分子生物学研究所への訪問は、Skype会議やメールでの意見交換で代用した。項目ii)の「時空間的相関イメージングを可能にする制御系の検討・構築」に関しては、現有の高速原子間力顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡とを組み合わせた相関イメージングシステムに関して、リアルタイムでの時空間的位置合わせ法の確立を目指して基礎データの取得を行い、空間精度に関して結果を得た。クラスリン被覆ピットのライブセル観察では、20nm程度という結果を得たが、これは超解像顕微鏡の空間分解能以上の誤差である。これは、原子間力顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡の走査位相のずれに起因するものであると考えられるため、今後、走査位相の同期を検討する必要がある。
Strategy for Future Research Activity	2018年度に引き続き、フェーズ1の計画を遂行する。光学系の導入に関しては、2018年度に議論したシステムの導入を実際におこなう。6月に欧州分子生物学研究所の共同研究者であるRiesが来日し、京都大学にて高速原子間力システムの改変に関する議論と実験を行う。また10月には、研究代表者および共同研究者が欧州分子生物学研究所を訪問し、超解像顕微鏡システムを見学し、その光学系を学ぶと共に、高速原子間力顕微鏡との融合に関して議論をおこなう予定である。また、時空間的同期法の確立に関しては、空間精度上昇に取り組むと共に、時間的同期法を検討する。2019年度からはフェーズ２「ハイブリッド顕微鏡を用いた膜変形・切り離し過程の可視化・解析」にも取り組み、フェーズ１で検討・構築した光学系を高速原子間力顕微鏡に組み込み、膜小胞生成過程の可視化解析に挑む。膜切り離しのステップには、これまで報告されてきたダイナミン以外に、多くのタンパク質の関与が報告されつつある。京都大学では、高速原子間力顕微鏡を用いた解析により、エンドサイトーシス過程における細胞骨格関連タンパク質の関与を示す重要なデータを得ている。また、欧州分子生物学研究所のグループでも、超解像顕微鏡を用いて、小胞周辺の細胞骨格の局在に関する高空間分解能局在情報の取得に成功している。ここでは、その両者を組み合わせ、クラスリン依存的エンドサイトーシスにおける膜変形・小胞生成の分子メカニズムを明らかにする。