2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism underlying DNA replication stress response regulating genomic instability
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18KK0235
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
塩谷 文章 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (10627665)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中田 慎一郎 大阪大学, 高等共創研究院, 教授 (70548528)
安原 崇哲 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (90757056)
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| Project Period (FY) |
2019-02-07 – 2022-03-31
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| Keywords | DNA複製ストレス / ATR / ゲノム不安定性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんドライバー遺伝子の活性化は、異常なDNA複製ストレスを誘発し、ゲノム不安定性を誘発する。これまでに、K-rasG12V肺腺がんモデルを作成したところ、DNA複製ストレス応答の中心的な役割を果たすATRの発現上昇がK-rasG12Vによって誘導される形質転換において必要十分条件を満たす結果をえている。本年度は、総RNA発現量を比較解析したところK-rasG12Vによって総RNA発現量が増加すること、また転写抑制剤によってDNA複製フォークの進行遅滞が回避されることからRNA転写がK-rasG12V 発現によるDNA複製ストレス要因の一つである結果を得た。昨年度までにK-rasG12Vによって誘導されるDNA複製ストレスの要因としてR-loop量の増加の関与が示唆されていたが、昨年度利用したS9.6抗体（RNA/DNA hybrid抗体）の免疫蛍光染色における特異性に疑義が報告されたため、Dot blot法に用いて再検討したところ、ATR高発現の有無にかかわらずK-rasG12VによるR-loop量の増加を認めなかった。またR-loopの解消に関わるRNaseH1を導入した細胞においてもK-rasG12Vによって誘導されるDNA複製フォーク進行遅滞が解消されなかった。さらに、RNA転写装置とDNA複製の衝突をPLA法にて検討したがDNA複製ストレスの要因となりうる結果を得られなかった。現在、K-rasG12V発現下におけるDNA複製ストレス要因としてクロマチン動態に注目しRNA発現変動とヘテロクロマチン形成の相互依存的な関係を明らかとし、DNA複製ストレスの要因としての可能性を検証している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
R2年度はコロナ禍の影響により研究に対して制限が多く、研究の進捗が遅れが生じることが懸念されたが、予定していたDNA複製ストレスの原因や複製ストレスの程度に関する大部分の実験を進めることができた。現在ゲノム不安定性誘発のメカニズムに関する解析を進めており、当初の予定通り研究を遂行しうる。
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| Strategy for Future Research Activity |
K-rasG12VによるDNA複製ストレス誘発要因を解析し同定する。KRASG12V発現によるDNA複製ストレスの要因としてヘテロクロマチンに注目する。ヘテロクロマチン化の指標としてHistone H3K9me3、H3K27me3、H1K25me3、HP1レベルを免疫染色法にて解析する。これらの解析において、転写阻害剤DRBやヘテロクロマチン解消剤CQ処理下におけるゲノム動態を評価するとともに、ゲノムDNAのMNase感受性試験によってゲノムのヘテロクロマチン状態を評価する。これらに加えてKRASG12V発現-/+, ATR高発現-/+条件下におけるRNAseq 解析を行い、RNA関連因子とヘテロクロマチン関連因子の相互依存的な関係を解析し、DNA複製ストレスの要因を同定する。またこれらと並行して形質転換後の細胞をクローニングし全ゲノム配列解析を行いATR高発現によって発生するゲノム異常の特徴について検討する。
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| Causes of Carryover |
昨年度、コロナウイルス蔓延による緊急事態宣言が発令されたため、研究の実施が予定どうりに進められなかったことが主要因である。次年度繰越額は昨年度実施を延期した全ゲノム解析を中心に使用を予定している。
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Research Products
(6 results)
