2019 Fiscal Year Research-status Report

Assessing molecular mechanisms of enhancement of memory retention using rats carrying conditional alleles.

Research Project

Project/Area Number	18KK0458
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	阿部学新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
Project Period (FY)	2019 – 2021
Keywords	遺伝子改変ラット / ドーパミン / ゲノム編集 / コンディショナル遺伝子発現制御
Outline of Annual Research Achievements	コンディショナル遺伝子発現制御法（生体内における遺伝子発現時間、発現量、発現細胞種などに任意の制限を加える方法）は遺伝子機能の解析技術として極めて強力であるが、内在遺伝子に対しての点変異や低分子タグのノックインなど微細な変異への適用が困難であることや、変異動物作製のため長い実験期間を要することが問題であった。研究代表者は基課題において、Cre/loxP組換え系を用いた新規コンディショナル遺伝子発現制御法とゲノム編集技術と組み合わせることで、従来の点変異/低分子タグ等のノックイン法が内包する問題点を克服できる可能性を見出し、その検証のため、遺伝子改変マウスを用いた小脳発達の分子機構の解明を目的とした研究を遂行中である。基課題の研究を発展させ、遺伝子改変ラットを用いた青班核ノルアドレナリンニューロンからのドーパミンシグナル伝達機構及び新奇体験による記憶保持の強化の分子機構の解明を目的とする国際共同研究をデンマークAarhus大学DANDRITE研究所の竹内倫徳博士と共に計画した。基課題にて開発されたコンディショナル低分子タグ発現カセットを用いたドーパミン受容体、ドーパミン生合成酵素等を標的としたノックインラットを作製して標的タンパクの発現、動態解析と行動試験を竹内研究室で行い、基課題の研究の発展性を実証しつつ本応募課題の目的を達成する。個別目標としては（１）青班核軸索と海馬神経細胞における神経伝達物質とその受容体の関係性の解析（２）青班核ニューロンからのドーパミン放出の分子機序の解析（３）記憶保持の強化過程における海馬ドーパミン受容体の機能解析を設定した。また、記憶保持の強化過程の解析に有用なcFos-tTAノックインラット系統の作製と解析も行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 代表者は次年度よりLister Hooded系統ラットES細胞からの新規遺伝子改変ES細胞の樹立と、通常の標的遺伝子組換え法またはゲノム編集法によるコンディショナルノックインラットの作製を国内にて研究協力者と共に行う。その後、作製したラットをDANDRITE研究所へ導入し、Cre活性依存的なノックイン遺伝子の発現検証、低分子タグ付加タンパクの動態解析、薬剤によるドーパミンシグナル伝達の制御可能なノックインラットの行動試験を行い、個別目標の達成を目指す。研究協力者である中務胞助教、夏目里恵技術職員、崎村建司フェローにより、国内に存在しなかったLister Hoodedラットコロニーを所属研究室において立ち上げ維持しており、今年度は、崎村らの手により生殖細胞系列伝達可能なLister Hooded系統ラットES細胞が樹立され、次年度からの遺伝子改変ES細胞樹立の準備が整えられている。また、中務を中心に遂行中であるゲノム編集技術を用いた遺伝子改変ラット作製技術の確立に研究代表者が協力することで、GONAD(Genome-editing via Oviductal Nucleic Acid Delivery)法によるノックインラット作製が安定して行えるようになりつつある。研究代表者の開発した新規ノックイン技術を用いることで、現在3kb程度のDNA配列のノックインにも成功している。代表者と海外共同研究者は定期的に研究方針と準備状況とについて打ち合わせており、計画通りに研究が進展しているという認識で一致している。
Strategy for Future Research Activity	研究代表者は、海外共同研究者の研究室において（1）2つの異なるドーパミン依存的な新奇性回路による日常の記憶の亢進、（2）絶対的新奇性による日常の記憶の亢進に関与するタンパク質の同定、（3）ドーパミン依存的な新たな情報の知識への統合を明らかにするための研究に参画することになる。代表者が技術的見地より個別の導入遺伝子変異について合議し、分子生物学、生化学、解剖学的実験を含んだ研究を遂行する。具体的には、作製されたラットを用い、組換え酵素Cre発現ウィルスベクターを標的脳部位である青班核や海馬へStreotaxicに導入することで、ノックイン遺伝子がCre活性依存的に発現することを組織学、生化学、分子生物学的手法により検証する。また、GONAD法を用いてラット胚に直接Creノックインを行うことで一世代コンディショナルノックインラット作製についても検討する。さらに、研究協力者が中心となり作製を進めているcFos-tTAノックインラット系統も樹立されつつあるため、先行してその系統の解析も行う予定である。本課題採択後の国内における準備期間には基課題の研究を並行して行っている。渡航期間中は基課題研究協力者の中務、夏目がマウスの飼育、繁殖並びに組織学、分子生物学、生化学、行動学的解析を行うことで基課題の研究についても遅滞なく遂行することが可能である。また、上記2 名が本課題の国内研究協力者として代表者の渡航中にもラットのES細胞培養、発生工学的操作、ゲノム編集技術の開発に従事するのに加え、国内における本課題の研究遂行、ラット飼育管理等のために実験補助1名を雇用する。