2021 Fiscal Year Research-status Report
Assessing molecular mechanisms of enhancement of memory retention using rats carrying conditional alleles.
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18KK0458
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
阿部 学 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (10334674)
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2019 – 2022
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| Keywords | 遺伝子改変ラット / ドーパミン / ゲノム編集 / コンディショナル遺伝子発現制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コンディショナル遺伝子発現制御法（生体内における遺伝子発現時間、発現量、発現細胞種などに任意の制限を加える方法）は遺伝子機能の解析技術として極めて強力であるが、内在遺伝子に対しての点変異や低分子タグのノックインなど微細な変異への適用が困難であることや、変異動物作製のため長い実験期間を要することが問題であった。研究代表者は基課題において、Cre/loxP組換え系を用いた新規コンディショナル遺伝子発現制御法とゲノム編集技術と組み合わせることで、従来の点変異/低分子タグ等のノックイン法が内包する問題点を克服できる可能性を見出し、その検証のため、遺伝子改変マウスを用いた小脳発達の分子機構の解明を目的とした研究を遂行中である。
基課題の研究を発展させ、遺伝子改変ラットを用いた青班核ノルアドレナリンニューロンからのドーパミンシグナル伝達機構及び新奇体験による記憶保持の強化の分子機構の解明を目的とする国際共同研究をデンマークAarhus大学DANDRITE研究所の竹内倫徳博士と共に計画した。基課題にて開発されたコンディショナル低分子タグ発現カセットを用いたドーパミン受容体、ドーパミン生合成酵素等を標的としたノックインラットを作製して標的タンパクの発現、動態解析と行動試験を行う。個別目標としては（１）青班核軸索と海馬神経細胞における神経伝達物質とその受容体の関係性の解析（２）青班核ニューロンからのドーパミン放出の分子機序の解析（３）記憶保持の強化過程における海馬ドーパミン受容体の機能解析を設定した。また、記憶保持の強化過程の解析に有用なcFos-tTAノックインラット系統、tTAの動作検証のためのtetO-H2B tdTomatoノックインラット、記憶保持と遺伝子発現の関係を明らかにするためのコンディショナルRpl22-HAノックインラットの作製と解析も行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
今年度はゲノム編集法によるノックインラットの作製と繁殖を国内にて研究協力者と共に行った。作製したラットについてはDANDRITE研究所へ導入し、個別目標の達成を目指す予定である。
研究協力者により作製された生殖細胞系列伝達可能なLister HoodedラットES細胞を用いることでcFos-tTAノックインキメララットを作製したが、体細胞でのノックイン遺伝子が確認できたものの生殖系列伝達が確認されなかった。そのため、ゲノム編集技術のGONAD(Genome-editing via Oviductal Nucleic Acid Delivery)法を改良することで、新たにcFos-tTAノックインラットの作製を試み、成功した。現在、生殖系列伝達を確認するとともに、cFos-tTAの動作検証のため、昨年度に樹立済みであるtetO-H2B tdTomatoノックインラットとの交配を行なっている。この改良されたノックイン技術については、論文投稿準備中である。また、コンディショナルRpl22-HAノックインラットについては作製を試みたが、変異遺伝子が部分的に挿入された個体が得られたのみであった。
代表者と海外共同研究者は定期的に研究方針と準備状況とについて打ち合わせており、順調に研究が進展しているという認識で一致しているが、代表者自身が渡航し、ノックイン遺伝子の発現検証、低分子タグ付加タンパクの動態解析、薬剤によるドーパミンシグナル伝達の制御可能なノックインラットの行動試験を行うという本課題の主要な目的については、令和3年度末時点でも新型コロナウイルス感染症のために実現できていない。そのため進捗状況に関しては「遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者は、海外共同研究者の研究室において（1）2つの異なるドーパミン依存的な新奇性回路による日常の記憶の亢進、（2）絶対的新奇性による日常の記憶の亢進に関与するタンパク質の同定、（3）ドーパミン依存的な新たな情報の知識への統合を明らかにするための研究に参画し、代表者が技術的見地より個別の導入遺伝子変異について合議し、分子生物学、生化学、解剖学的実験を含んだ研究を遂行する予定である。cFos-tTAノックインラット系統も樹立されつつあるため、先行してその系統の解析も行う予定である。
しかし新型コロナウイルス感染症流行のため、現時点では渡航については見合わせている状況であり、渡航可能となった場合に備え、国内で実施可能な研究を継続中である。すなわち、主としてcFos-tTAノックインラット系統の樹立と、その動作確認をtetO-H2B tdTomatoノックインラットを用いて進める。tTA活性については脳組織透明化によって評価する予定である。低分子タグノックイン系統（Rpl22-HAノックインラット）については、部分的に変異遺伝子の挿入された個体を用いて、挿入されていない部分を補完するようにノックインすることで完全な変異ラットを作製する。また、コンディショナルノックインラット系統についても作製を進め、これらの樹立できた系統については可能な限りその動作確認を行い、海外共同研究者へ搬送する。
なお、昨年度に発生工学的実験を支援する主たる国内研究協力者一名が予期せず離職し、国内における本課題の研究遂行に支障が生じているため、次年度には発生工学的実験の補助とラット飼育管理等のために実験補助員1名を雇用する予定である。
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Research Products
(7 results)
