2008 Fiscal Year Annual Research Report
生体内シグナル伝達分子を標的とした蛍光バイオセンサーの創製
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19021023
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森井 孝 Kyoto University, エネルギー理工学研究所, 教授 (90222348)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田井中 一貴 京都大学, エネルギー理工学研究所, 助教 (80506113)
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| Keywords | バイオセンサー / 蛍光プローブ / リン酸化チロシン / RNA / ペプチド / リボヌクレオペプチド / インビトロ・セレクション / リン酸化アミノ酸 |
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| Research Abstract |
(1) 二種類の標的分子を同時計測できるデュアルバイオセンサーの構築
異なった波長で応答する二種類のバイオセンサーを使用する事により、二元同時センサーを作製した。Cy5をN末端に導入したペプチドを用いて作製した光応答性ATPリセプターライブラリーから、効率よく光応答する蛍光性センサーを得た。GTPに対しても同様に、フルオレセインを導入した光応答性GTPリセプターライブラリーから光応答するセンサーを選出した。得られたリボヌクレオペプチドセンサーのRNAサブユニット3'末端を参加し、蛍光性RevペプチドのC末端に導入したヒドラジド基と反応させることにより、共有結合で連結された蛍光性RNPセンサーを合成した。異なった波長で応答するATPセンサーとGTPセンサーを同時に用いることにより、ATPとGTPを同時に計測できる二元同時センサーの作製に成功した。異なった波長で応答する二種類のバイオセンサーを使用する事により、二元同時センサーを作製した。Cy5をN末端に導入したペプチドを用いて作製した光応答性ATPリセプターライブラリーから、効率よく光応答する蛍光性センサーを得た。GTPに対しても同様に、フルオレセインを導入した光応答性GTPリセプターライブラリーから光応答するセンサーを選出した。得られたリボヌクレオペプチドセンサーのRNAサブユニット3'末端を参加し、蛍光性RevペプチドのC末端に導入したヒドラジド基と反応させることにより、共有結合で連結された蛍光性RNPセンサーを合成した。異なった波長で応答するATPセンサーとGTPセンサーを同時に用いることにより、ATPとGTPを同時に計測できる二元同時センサーの作製に成功した。
(2) 細胞抽出液中でのセンシング
上記(2)で合成した共有結合性ATPセンサーとGTPセンサーは、ヌクレアーゼ耐性が向上した。それぞれのセンサーは、細胞抽出液中でも効率よくATPもしくはGTPを検出・定量する事が可能であった。
(3) 細胞内イノシトール四リン酸動態のリアルタイム計測
天然タンパク質を基にIP4に対する蛍光性センサーを構築し、試験管内および細胞内においてIP4濃度変化の検出に成功した。また、IP4センサーとカルシウムセンサーfura-2を同時に用いて、IP4とCa2+挙動の単一細胞内リアルタイム検出に成功した。
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