2007 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内微小空間の温度分布を可視化する蛍光性温度センサーの開発
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19021024
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
清中 茂樹 Kyoto University, 工学研究科, 助教 (90422980)
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| Keywords | 温度センサー / コイルドコイル / GFP / センサー |
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| Research Abstract |
今年度は、TlpA(37℃)とは異なる温度領域を感知できる温度センサーおよび異なる蛍光波長を有する温度センサーの構築を行った。また、細胞内応答を評価するためにセンサー感度の向上を遂行した。
「検出温度・蛍光波長の拡張」
TlpA(37℃)以外の温度領域を検出するために、TlpAの点変異を行って融解(検出)温度を変えた。また、検出温度の大幅な変更を行うためにTlpA以外のcoiled-coilタンパク質(tropomyosinなど)を用いたセンサーを構築した。
「センサー感度の向上」
PRIMを用いた第一世代の温度センサーは、細胞内での評価を行なうにはratio380/480の変化量が不十分であった。そこで、感度向上を目指してcircular permutation法(Tsien, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999)を採用した。この方法では、GFPのN末端及びC末端をβシート構造近傍に移動することで、構造変化が蛍光変化としてより反映されやすいと期待される。この方法論を用いることでcoiled-coilによる構造的な歪みがより強くなり、蛍光変化量が大幅に上昇することが確認できた。
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