2007 Fiscal Year Annual Research Report
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19036005
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
深井 周也 The University of Tokyo, 放射光連携研究機構, 准教授 (10361792)
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 低分子量GTPase / 小胞輸送 / 膜融合 |
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| Research Abstract |
出芽酵母で報告されているYipタンパク質(Yiplp, Yip2p, Yip3p, Yip4p, Yip5p, Yiflp)のうち、イントロンを含むYip3p以外について出芽酵母のゲノムから遺伝子をクローニングした。Yip2pはゲノムデータベース上に発表されている配列と5'端の配列が異なっており、ORFが明確でなかったので発現の候補から除外した。最終的にYip1p, Yip4p, Yip5p, Yiflpの4種類をメタノール資化性酵母Pichiα pastorisの発現ベクターであるpPICZおよびpPICZαに組み込んだ。マニュアルに従ってエレクトロポレーション法による形質転換を行ったが、高発現に適するマルチコピーの形質転換体を得るのに十分な形質転換効率が得られなかった。そこで、DTTとLi_2SO_4で細胞を処理することにより形質転換効率を上げることを試みた。その結果、形質転換効率を大幅に改善することができ、Yip1pについては2g/LのZeocin存在下で生育することが可能な形質転換体を多数得ることができた。いくつかの形質転換体に対してメタノール添加による発現誘導を行い、膜画分を調製してHis_6タグに対する抗体を用いて発現の確認を行ったが、発現を確認できなかった。N末端にα-factorやHisタグを付加したコンストラクトでの大量発現を試みる予定である。また、pETベクターを使って大腸菌で大量発現したヒト由来のYip3pでGDF活性を測定している例が報告されているので、Pichiαの発現系を構築するのと並行して、pETベクターを用いた発現系の構築も行った。Pichiaの発現系と同様に膜画分を調製して、発現を確認する予定である。
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