2007 Fiscal Year Annual Research Report
細菌の多剤耐性化に関与するインテグラーゼの結晶構造と基質-酵素相互作用の解析
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19041061
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山口 佳宏 Kumamoto University, 環境安全センター, 准教授 (10363524)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒崎 博雅 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 准教授 (70234599)
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| Keywords | 多剤耐性菌 / 遺伝子組み換え酵素 / X線結晶構造解析 / 速度論的解析 / 酵素 / 熱力学的解析 / 核酸認識 / インテグロン |
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| Research Abstract |
多剤耐性となったサルモネラ菌、病原性大腸菌などが海外のみならず日本で分離されており、それらの染色体、伝達性プラスミドに多数の薬剤耐性遺伝子を集積したインテグロン構造を有しているものが発見されている。インテグロン構造には、これらの遺伝子の切り取り、挿入を促進させる酵素インテグラーゼ(IntI)の遺伝子が必ず存在する。本研究は伝達性プラスミド上に存在し、細菌の多剤耐性化に関わるIntI1を研究対象として、X線結晶構造解析、物理化学的手法を用いて、原子レベルで基質-酵素認識機構を理解し、その結合力を数値化することで、その酵素の反応機構と基質認識機構を詳細に解明し、多剤耐性化による細菌の自然適応能力を理解することが目的である。平成19年度は、IntI1の大量発現系の構築と精製条件の検討を行った。N末端にHis-Tagを融合させるpET28aにIntI1遺伝子を組み込んだIntI1/pET28aは可溶化に成功しなかった。次に翻訳効率を高め、可溶化を促進させるpCold IIIにIntI1遺伝子を組み込んだところ、可溶化に成功した。しかしIntI1の分子量だけでは精製条件を検討するには難しいと判断し、N末端にHis-Tagを融合させるpColdIにIntI1遺伝子を組み込んだところ、IntI1を発現させた大腸菌BL21(DE3)の超音波破砕時にNaC1が含まれていると、IntI1は可溶化しないことがわかった。
現在、IntI1の精製条件を検討中である。
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