2007 Fiscal Year Annual Research Report
物性の人工制御による高難度タンパク質の新規生産・解析手段の開発と応用
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19206085
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
山田 秀徳 Okayama University, 大学院・自然科学研究科, 教授 (80037613)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
二見 淳一郎 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 講師 (00420498)
妹尾 昌治 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (90243493)
多田 宏子 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 助教 (60271061)
小坂 恵 岡山大学, 自然生命科学研究支援センター, 助手 (00170233)
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| Keywords | タンパク質 / 化学修飾 / 結晶化 / 格子工学 / 細胞内導入 / フォルディング / タンパク質工学 / バイオテクノロジー |
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| Research Abstract |
本研究は、従来の研究手法では取り扱いが難しい高難度タシパク質について、その新規生産法の開発や、機能解析・工学的応用に関する各種の基盤技術を開発することを目的としている。本年度は以下の研究項目について研究成果を得た。
(1)in cellフォルディング法の確立と人工タンパク質生産技術への応用
変性タンパク質のシステイン残基にジスルフィド結合を介して正電荷を導入して可溶化した可逆的変性カチオン化タンパク質を、細胞内に導入して機能を発現した量として評価するため、人工転写因子タンパク質とレポーター遺伝子を用いた評価系を用いて導入条件の最適化を行った。その結果、エンドソームを不安定化する両親媒性ペプチドを併用することで飛躍的に導入効率が向上できることを見出した。
(2)正電荷の一過的な保護技術によるカチオン化タンパク質の物性制御
カチオン化タンパク質の正電荷を一過的に保護する各種の技術開発に取り組み、20merのオリゴRNAを用いることで一過的な保護が可能なことを見出した。すなわち、オリゴRNAと複合体を形成したPEIカチオン化タンパク質は細胞内には取り込まれないが、この複合体をRNaseにより処理することで、再び細胞内導入が可能で、invivoでの広範な組織内へのタンパク質導入を可能とする基盤技術として期待できる。
(3)結晶化タグを用いた結晶分子配向性制御
難結晶性タンパク質の1つであるヒトRNase1の分子表面の2次構造上にロイシンを配置させることで結晶化のパッキング面を創成することに成功した実績に基づき、ウシRNaseAにロイシンによるパッキング面を作成し結晶化を行った。その結果、新たに創成したパッキング面を利用した結晶化が可能なことが確認され、結晶分子の配向性制御に本手法が有用なことが立証された。
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