2008 Fiscal Year Annual Research Report
多糖-endo型グリコシダーゼ複合体解析に基づく反応機構解明研究
| Project/Area Number |
19380064
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
橋本 勝 Hirosaki University, 農学生命科学部, 教授 (40212138)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮入 一夫 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (10003526)
斎藤 稔 弘前大学, 理工学研究科, 教授 (60196011)
城所 俊一 長岡技術科学大学, 工学部, 准教授 (80195320)
清水 弘樹 独立法人産業技術総合研究所, 創薬シーズ探索ラボ, 研究員 (30344716)
清水 哲哉 独立法人理化学研究所, 研究技術開発室, 研究員 (80435651)
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| Keywords | エンドグリコシダーゼ / セルラーゼ / エンドポリガラクツロナーゼ / 基質アナログ / 硫黄置換誘導体 / 遷移状態アナログ / 化学合成 / 複合体形成 |
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| Research Abstract |
本研究では、これまでの知見を踏まえ、endo-PG1を中心にendo型グリコシダーゼの反応機構の詳細、特に反応部位の反応中間体におけるグリコシド結合、ピラノース部分の立体配座の変化、エネルギー変化を中心に検討した。
報告者が先に報告した硫黄置糖鎖アナログの場合、酵素との複合体での基質配座ではなく、遊離状態における安定配座のミミックを目指しており、ソーキング実験でグリコシダーゼ-糖鎖反応中間体を再現するに至らなかったものと推定できる。アカルボースに倣い、シクロヘキセン構造を糖鎖の中央に導入したオリゴ糖の合成を行い、それを評価した。
【研究の方法】セルラーゼを標的としたセルロース誘導体として、基質アナログ、および推定遷移状態アナログの合成を行い、これらの酵素との反応について検討した。同様にendo型ポリガラクツロナーゼを標的とした、推定反応遷移状態基質アナログの合成を行った。一方、糖鎖-酵素複合体を考察する目的として、動力学的計算法(COSMOS90)の最適化を行わた。さらに、エンド型ポリガラクツロナーゼのシグナルペプチドと思われる配列の役割を検討した。
【研究成果】合成したアナログ天然型三量体はNOE測定比較により硫黄置換アナログは天然基質を類似した安定配座を取っていることを明らかにした。カロリメトリー実験では酵素との複合体形成を観測できなかつた。しかし遷移状態アナログはエンドグルカナーゼVと複合体形成をすることを明らかにした。しかしその結合は酵素反応を説明するには弱いものであり、反応部位から離れたサブサイトの重要性が明らかになった。
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[Journal Article] Isolation and absolute stereochemistry of optically active sydonic acid from from Glonium sp. (Hysteriales, Ascomycota)2009
Author(s)
Kudo, S., Murakami, T., Miyanishi, J., Tanaka, K., Takada. N., Hashimoto, M
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Journal Title
Biosci. Biotech. Biochem 73
Pages: 203-204
Peer Reviewed
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[Journal Article] Syntheses of Lambertellols and Their Stable Analogues ; Investigation of the Real Active Species in the Mycoparasitism by Lambertella Speciese2008
Author(s)
Nomiya, M., Murakami, T., Takada, N., Okuno, T., Harada, Y., Hashimoto, M.
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Journal Title
J. Org. Chem 73
Pages: 5039-5047
Peer Reviewed
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[Journal Article] Synthesis of D-trigalacturonic acid methylglycoside2008
Author(s)
Yamamoto, K., Sato, Y., Ishimori, A., Miyairi, K., Okuno, T., Nemoto, N., Shimizu, H.,Kidnknro. S., Hashimoto. M.
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Journal Title
Biosci. Biotech. Biochem 71
Pages: 1230-1235
Peer Reviewed
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[Journal Article] Expression, purification, and analyses of glycosylation and disulfide bonds of Stereum purpreum endopolygalacturonase I in Pichia pastoris2008
Author(s)
Ogawa, S., Shimizu, T., Ohki, H., Araya, T., Okuno, T., Miyairi, K.
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Journal Title
Protein Expression and Purification 65
Pages: 15-22, 2009
Peer Reviewed
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[Journal Article] Role of the IXI/V motif in oligomer assembly and function of StHsp14.0, a small heat shock protein from the acidothermophilic archaeon, Sulfolobus tokodaii strain 72008
Author(s)
Saji, H., Iizuka, R., Yoshida, T., Abe, T., Kidokoro, S., Ishii, N., Yohda, M.
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Journal Title
Proteins : Struct. Funct. Genet 71
Pages: 771-782
Peer Reviewed
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[Journal Article] Thermodynamic basis for the stabilities of three CutAls from Pyrococcus horikoshii, Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temneratures2008
Author(s)
Sawano, M., Yamamoto, H., Ogasahara, K., Kidokoro, S., Katoh, S., Ohnuma, T., Katoh, E., Yokovama. S.. Yutani. K.
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Journal Title
Biochemistry 47
Pages: 721-730
Peer Reviewed
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[Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of galectin LEC-1 from Caenorhabditis elegan2008
Author(s)
Itagaki, T., Nishizaki, S., Sekihashi, K., Kobayashi, H., Kidokoro, S., Kezuka, Y., Arata, Y., Hirabayashi, J., Kasai, K. -I., *Nonaka, T.
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Journal Title
Protein Peptide Lett 15
Pages: 419-422
Peer Reviewed
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