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2007 Fiscal Year Annual Research Report

巨大DNAを効率良く導入するマイクロキャリアーの開発の導入領域の分子細胞学的解析

Research Project

Project/Area Number 19380194
Research InstitutionOsaka Kyoiku University

Principal Investigator

向井 康比己  Osaka Kyoiku University, 教育学部, 教授 (30110795)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 福井 希一  大阪大学, 工学研究科, 教授 (00311770)
Keywords巨大DNA / 形質転換 / 穀粒品質遺伝子 / マイクロキャリア / バイオアクティブビーズ / 人工染色体 / 可視化 / イネ
Research Abstract

今年度は、まずまじめに、コムギ粉硬質・軟質に関与する遺伝子群(puroindoline-a、puroindoline-b、GSP-1)を含むBAC10を、ハイグロマイシン耐性の遺伝子をもつベクターにつなぎ変え、バイオビーズ法に適した選択マーカーをもつコンストラクトを作製した。アルギン酸カルシウムのサイズ、粘度、加えるDNAの量、PEGの濃度などのパラメータについて形質転換効率に対しての最適な組み合わせを検討し、イネプロトプラストを対象に100kbサイズの巨大DNAを効率良く導入するための条件を明らかにした。そして、バイオビーズ法を用いて複数のコムギ遺伝子を含む約100kbの巨大DNAを導入した20個体の形質転換イネの作出に成功した。導入遺伝子の存在は、導入遺伝子をターゲットとしたPCR、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。PCR解析の結果は、導入遺伝子の存在と共に、巨大DNAの中でいくつかの再編成が起きている事を示唆した。一方で、サザンハイブリダイゼーションの結果は、すべての形質転換体で低コピーの遺伝子導入が起きている事を示唆した。これらの結果は、バイオビーズ法を用いた巨大DNA断片の導入による形質転換イネの作出が可能であること、また本手法が低コピーの遺伝子導入を可能とする手法であることを示した。さらに、導入DNAのFISHによる可視化技術を開発した。得られた形質転換体の内、ホモ個体はFISHにより2対のシグナルを持っていることで確認した。このホモ個体において導入遺伝子の発現をRNAレベル、タンパク質レベルで解析した。これらの結果は、安定な遺伝子発現を実現するために巨大DNA内の再編成を回避する手段の必要性とともに、バイオビーズ法を用いたオーセンティックなプロモーター領域をも含んだコムギ巨大DNA断片導入による形質転換イネ作製という本研究の妥当性を示した。

  • Research Products

    (3 results)

All 2008 2007

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] Extended DNA fiber FISH in plants: Visible messages from cell nuclei2007

    • Author(s)
      山本真紀
    • Journal Title

      Nucleus 50

      Pages: 439-452

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Development of a new plant transformation system with large DNAs using bioactive beads methods2008

    • Author(s)
      和田直樹
    • Organizer
      The 1st international global COE symposium on Bio-Environmental Chemistry
    • Place of Presentation
      Hotel Hankyu EXPO Park Osaka
    • Year and Date
      2008-01-28
  • [Presentation] バイオアクティブビーズ法によるコムギ有用遺伝子群を含む巨大DNAのイネへの導入2007

    • Author(s)
      和田直樹
    • Organizer
      大阪大学イノベーションセミナー2007
    • Place of Presentation
      大阪大学
    • Year and Date
      2007-10-22

URL: 

Published: 2010-02-04   Modified: 2016-04-21  

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