生細胞における非天然型アミノ酸のタンパク質への導入技術の開発

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19380195
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 坂本 健作 The Institute of Physical and Chemical Research, 拡張遺伝暗号システム研究チーム, チームリーダー (50240685)
• Keywords: 非天然型アミノ酸 / ピロリジルtRNA合成酵素 / 蛍光標識 / 翻訳後修飾 / アセチルリジン / 動物細胞

Research Abstract

[PylRS変異体の開発とタンパク質蛍光標識法の拡充]古細菌Methonosarcina mazei由来のピロリジルtRNA合成酵素(PylRS)のアミノ酸結合部位に,立体構造情報に基づいてアミノ酸置換を導入して,Nε-ベンゾイルオキシカルボニルリジン(Z-Lys)に特異的な変異体を作成することに成功した.Z-Lysは,PylRSの本来の基質であるピロリジンに比べてもさらに大きなアミノ酸である.この変異体を利用して,Z-Lysのアリール基上にアジト基を導入したアジド-Z-リジン(AzZLys)を,哺乳類細胞,大腸菌のそれぞれのシステムでタンパク質に導入することができた.さらに,アジト基とトリアリール・フォスフィンの選択的な反応を利用して,タンパク質を部位特異的に蛍光標識することに成功した.昨年度のアジトフェニルアラニンを用いる方法に加えて,さらにAzZLysを用いる蛍光修飾法を開発したことで,用途に合わせて,いずれかの方法によってタンパク質を部位特異的に蛍光標識することを可能にした.
[アセチルリジンの部位特異的導入法の開発]アセチルリジンは,ヒストンのC末端付近に見出される翻訳後修飾アミノ酸であり,クロマチンの動態変化に主要な役割を果たしている.そこで,アセチルリジンをタンパク質に部位特異的に導入するシステムを開発した.アセチルリジンを認識するMethonosarcina barkeri由来のPylRS変異体が,他の研究グループから報告されていたが,変異をM.mazei PylRSに移植した上で改良を施したmAcLysRSを作成した.mAcLysRSを哺乳類細胞で発現させることによって,アセチルリジンを部位特異的に導入したタンパク質の調製に成功した.質量分析によって,指定の位置にアセチルリジンが導入されたことが確認された.

Research Products

• [Journal Article] Recognition of non-α-amino substrates by pyrrolysyl-tRNA synthetase (2009)
  • Author(s): Kobayashi, T., Yanagisawa, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 385 Pages: 1352-1360
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Multi-step engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode Nε-(o-azidobenzyloxycarbonyl)lysine for site-specific protein modification (2008)
  • Author(s): Yanagisawa, T., Ishii, R., Fukunaga, R., Kobayashi, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Chemistry & Biology 15 Pages: 1187-1197
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transplantation of a tyrosine editing domain into a tyrosyl-tRNA synthetase variant enhances its specificity for a tyrosine analog (2008)
  • Author(s): Oki, K., Sakamoto, K., Kobayashi, T., Sasaki, H. M., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 105 Pages: 13298-13303
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Adding L-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases (2008)
  • Author(s): Mukai, T., Kobayashi, T., Hino, N., Yanagisawa, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications 371 Pages: 818-822
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallographic studies on multiple conformational states of active-site loops in pyrrolysyl-tRNA synthetase (2008)
  • Author(s): Yanagisawa, T., Ishii, R., Fukunaga, R., Kobayashi, T., Sakamoto, K., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 378 Pages: 634-52
  • Peer Reviewed
• [Presentation] タンパク質の特定のモチーフを介するタンパク質間相互作用の細胞内光クロスリンク法による網羅的解析 (2008)
  • Author(s): 樋野展正, 尾山大明, 佐藤文, 向井崇人, 秦裕子, 山本雅, 坂本健作, 横山茂之
  • Organizer: 第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会(BMB2008)
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2008-12-12