骨格原基の細胞凝集形成に関わる分子の包括的機能解析法の確立と新規制御因子の同定

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19390475
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 二藤 彰 Tsurumi University, 歯学部, 教授 (00240747)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴田 達也 鶴見大学, 歯学部, 助教 (90323708) ; 荒木 良子 放射線医学総合研究所, 先端遺伝子発現研究グループ, 研究員 (40392211)
• Keywords: 遺伝子 / 軟骨細胞 / 分化 / 骨格

Research Abstract

骨格原基細胞凝集の制御因子を同定することは、骨格形成機構を理解するうえで極めて重要である。その目的でin vivoの微少な組織から特異的に発現している遺伝子を直接かつ網羅的行う方法を確立することが必要であると考え、新規高精度発現プロフィール法(HiCEP法)を応用した微量サンプル解析法を考案し、萌芽的な研究として平成18年度から科学研究費補助金萌芽研究で開始した。すでに解析法の確立がすすみ、すでに約3万の転写産物を解析し、細胞凝集部位特異的に発現変動が認められる転写産物が約300種類得られ、それらのうち多くの遺伝子配列を同定した。候補遺伝子は凝集塊そのものに高い発現を示すと予想される遺伝子群であるため、より詳細な時間的空間的局在を知るため、ホールマウントin situ hybridizationを行った。とりわけ、多数の分子について同時に発現解析を行うための方法として、従来の方法を改良した包括的ホールマウント遺伝子発現解析法comprehensive whole mount in situ hybridization(cWISH)の確立を行った。従来の方法では、プローブラベルはクローニングベクターに組み込んでラベルをする数百もの多数の分子を扱う上で、従来の方法では時間と手間を要するため、PCRをべースとしたラベル法を考案した。まずmRNAを鋳型にしてcDNAを合成し、続いて両端のプライマーによってPCRを行う。それに対して端にT3orT7 RNA polymeraseの認識部位を付加したプライマーでnested PCRを行う。それをテンプレートとしたRNA probe合成を行う。すべて96ウェルプレートで行えるので、他種類のプローブを簡便に作製することが可能である。それらを用い約100遺伝子について発現解析を行った。多くが骨格原基やその周囲に特徴的な発現をすることを観察し、この包括的遺伝子発現解析法の有用性を確認した。現在それらの遺伝子発現をさらに詳細に解析している。

Research Products

• [Journal Article] PlexinD1 deficiency induces defects in axial skeletal morphogenesis. (2007)
  • Author(s): Kanda T, Yoshida Y, Izu Y, Nifuji A, Ezura Y, Nakashima K, Noda M.
  • Journal Title: J Cell Biochem 101 Pages: 1329-37
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Long-term effects of local pretreatment with alendronate on healing of replanted rat teeth (2007)
  • Author(s): Ishijima M, Tsuji K, Rittling SR, Yamashita T, Kurosawa H, Denhardt DT, Nifuji A, Ezura Y, Noda M.
  • Journal Title: J Endocrinol 193(2): Pages: 235-43
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ihh/Gli2 Signaling Promotes Osteoblast Differentiation by Regulating Runx2 Expression and Function. (2007)
  • Author(s): Shimoyama A, Wada M, Ikeda F, Hata K, Matsubara T, Nifuji A, Noda M, Amano K, Yamaguchi A, Nishimura R, Yoneda T
  • Journal Title: Mol Biol Cell. 18(7): Pages: 2411-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deficiency of CIZ, a nucleocytoplasmic shuttling protein, prevents unloading-induced bone loss through the enhancement of osteoblastic bone formation in vivo. (2007)
  • Author(s): Hino K, Nakamoto T, Nifuji A, Morinobu M, Yamamoto H, Ezura Y, Noda M.
  • Journal Title: Bone 40(4) Pages: 852-60
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Protein Related to DAN and Cerberus(PRDC)is expressed in skeletogenesis and prevents osteoblastic differentiation (2007)
  • Author(s): Nifuji A, Ideno H, Takanabe R, Shimada A, Araki R, Abe M
  • Organizer: The 29th meeting of the American Society for Bone and Mineral Research
  • Place of Presentation: Honolulu
  • Year and Date: 20070916-19