2007 Fiscal Year Annual Research Report
スフィンゴミエリン代謝系酵素の構造および細胞生物学的な解析
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19570113
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
津下 英明 Tokushima Bunri University, 健康科学研究所, 教授 (40299342)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝沼 信彦 徳島文理大学, 健康科学研究所, 教授 (50035375)
小田 真隆 徳島文理大学, 薬学部, 助教 (00412403)
桜井 純 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (80029800)
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| Keywords | スフィンゴミエリン代謝系酵素 / スフィンゴミエリナーゼ / スフィンゴシンキナーゼ / 結晶構造解析 / 巻き戻し / 局在化 |
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| Research Abstract |
(1)Bc-SMase-阻害剤複合体の結晶構造解析:新規のスフィンゴミエリナーゼ阻害剤を用いて複合体結晶のスクリーニングおよびソーキングによりデータ収集を進めてきたが,残念ながら,まだ複合体結晶には至っていない。今後,基質も含めて複合体の構造を明らかにしたいと考えている。
(2)組み換え体ヒトスフィンゴシンキナーゼ(SPHK1)の発現,精製:SPHK1の大量発現系を構築するためにHis tagged SPHK1(pET15b)の発現を行った結果,可溶性画分に得られるSPHK1はわずかであった。このため大腸菌で発現のインクルージョンボディ(IB)を用いた巻き戻しを試みた。このSPHK1をニッケルキレートクロマトグラフィーにより精製した。このSPHK1は活性があることを確認し,さらに質量分析によりSPHK1である事を同定した。ただし巻き戻しが不完全な分子も混在していた。今後,結晶化に向けて,ゲル濾過により更なる精製が必要である。ニッケルキレートクロマトグラフィーにより精製したSPHK1はカルモジュリンに結合した。今後,大腸菌で高発現したカルモジュリンを用い共精製を計画している。
(3)SPHK1局在化機構の解明:SPHK1の細胞膜の他のキナーゼによるリン酸化による調節あるいは細胞膜への移行に他のタンパク質が関与するのか等まだ不明な点が多い。ヒト細胞でSPHK1を発現させ,膜への移行機構を明らかにするために,HEK293細胞での発現およびこのFlag tag SPHKIに結合するタンパク因子の同定をnano LC MS/MSを用いて進めており,現在得られている分子の確認を行っている。
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