2008 Fiscal Year Annual Research Report
非破壊定量システムを利用したダイアンソウイルス増殖関連宿主因子遺伝子の単離
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19580046
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
海道 真典 Kyoto University, 農学研究科, 助教 (20314247)
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| Keywords | 細胞間移行 / 移行タンパク質 / 小胞体膜 / RNAウイルス / 複製酵素 |
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| Research Abstract |
Red clover necrotic mosaic virus (RCNMV)感染細胞中において、移行タンパク質(MP)は、原形質連絡が存在する細胞壁だけではなく表層小胞体(ER)膜に大きな塊を形成して局在し、同所においてRCNMV複製酵素成分タンパク質と共局在する性質をもつ。しかしMPは単独で発現した場合には、ERには局在せずに専ら細胞壁に局在する。RCNMV MPがERに局在する条件について詳細に検討したところ、RCNMV MPをコードしないRNA1の複製と密接に関連することがわかった。RCNMV複製酵素成分タンパク質はそれ自身がER局在性を有するが、これらのタンパク質自体にはMPをERへリクルートする能力はなかったことから、MPは複製酵素複合体に含まれる宿主タンパク質と相互作用するのではないかと考えられた。この現象のウイルス学的意義について調べるために、ER局在性を失わせるようなMPの変異体を発現する組み換えウイルスを作製し、宿主植物に接種したところ、変異MPのER局在性の喪失と組み換えRCNMVの細胞間移行能の喪失が平行関係にあることがわかった。変異MPは細胞壁への局在性もタンパク質の安定性も、野生型MPと同レベルであり、またMPはRCNMVゲノムRNAの複製には全く関与しないことから、RCNMV MPのER局在性はウイルスの細胞間移行戦略にとって必須の過程であることが強く示唆された。現在、変異MPの原形質連絡排除限界増大能力が落ちていないことを確認するためのparticle bombardment実験を準備している。
ウイルス解析と平行して、RCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子を同定する目的で、Tandem Affinity Purification用のタグ配列を付加したMPを発現する組み換えRCNMVを感染させたNicotiana benthamiana葉から2段階免疫沈降法によるMPの精製を行い、in vivoにおいてMPと結合する能力を有する複数の宿主因子候補タンパク質を得た。近日中に候補タンパク質の質量分析を行い、遺伝子を同定する予定である。これらについては大量発現および発現抑制形質転換植物を作出してその機能について詳しく解析する予定である。
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