2008 Fiscal Year Annual Research Report
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19580235
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
荒木 利芳 Mie University, 大学院・生物資源学研究科, 教授 (40091368)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
苅田 修一 三重大学, 大学院・生物資源学研究科, 准教授 (90233999)
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| Keywords | ウシケノリ / プロトプラスト / β-1.4-マンナン / β-1,3-キシラン / ポルフィラン / 蛍光 / Carbohydrate binding module / 細胞壁 |
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| Research Abstract |
本研究はアマノリ細胞壁多糖分解酵素(β-1,4-マンナナーゼ-C (ManC)、β-1,3-キシラナーゼA(TxyA)、アガラーゼD (AgaD))に存在する各CBMを蛍光標識し、これら蛍光CBMをプローブとして、アマノリと同じ科に属するウシケノリから単離したプロトプラストを用いて、細胞壁が構築される様子を観察し、細胞壁の構造に関する知見を得ることを目的としている。
平成19年度はManC由来CBMとTxyA由来CBMをそれぞれ大腸菌で発現させ、GFP融合タンパク質を調製し、これらGFP蛍光CBMはそれぞれβ-1,4-マンナンおよびβ-1,3-キシランに結合することを確認した。しかしながら、AgaDCBMのGFP融合体はアガロースに対する結合力が非常に弱かった。また、TxyA蛍光CBMはウシケノリ細胞壁に対する結合力が非常に弱かった。よって、本実験ではManC由来蛍光CBM(GFP-CBM27)を用いて、ウシケノリプロトプラスト表面におけるβ-1,4-マンナン形成を蛍光顕微鏡で観察した。まず、ウシケノリ葉体をパパインで前処理後、3種類のアマノリ細胞壁多糖分解酵素で処理し、プロトプラストを単離した。これらプロトプラストは60時間までは試験管で培養したものを、それ以後はガラスカバーに付着したものを用いた。その結果、GFP-CBM27は12時間培養後のプロトプラストで結合が観察され始めた。60時間培養でプロトプラスト全体がβ-1,4-マンナンで覆われることが判明した。また、12, 24, 36, 48および60時間ではそれぞれ3, 12, 17, 29, 25%のプロトプラストの細胞表面にGFP-CBM27の結合が観察された。以上の結果から、ウシケノリプロトプラストは12時間後からβ-1,4-マンナンを中心とした細胞壁を形成し始めることが明らかになった。
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