コンディショナルノックアウトマウスによるRecQL5ヘリケースの生体で機能解析

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19590414
• Research Institution: Japanese Foundation For Cancer Research
• Principal Investigator: 池田 美香 Japanese Foundation For Cancer Research, 癌研究所・細胞生物部, 研究員 (70370153)
• Keywords: RecQヘリケース / Recq15 / コンディショナルK0マウス / cre-loxPシステム

Research Abstract

1.Recq15(Q5)コンディショナル欠失マウス作製。(1)ES細胞遺伝子改変のためのベクター構築。Q5分子には特異的N端領域は殆どなく、エクソン2からヘリケースドメインをコードしている。そこでコンディショナルKOアレルは122(3N+2)塩基長のエクソン2を欠失できるものにした。またイントロン1、2内で転写因子結合配列など特別な塩基配列をもたない領域を検索し、loxPまたはloxP-neo耐性遺伝子-loxPを挿入した。最終的に、組み替え領域-イントロン1(loxP挿入あり)-エクソン2-イントロン2(loxP-neo耐性-loxP挿入あり)-組み替え領域、をもつターゲティングベクターを構築した。(2)相同組換えES細胞クローンの分離。ベクターをES細胞に導入、ネオマイシンによる選別とサザンプロット法による遺伝子型の確認により6個のクローンを得た。これらES細胞クローンにおけるQ5発現をRT-PCRで調べたところ、neo耐性遺伝子挿入による発現低下などの作用はみられなかった。発現低下変異アレルではないので、このアレルのマウスは必要ないと判断した。そこで、次にこれらのクローンにcreリコンビネースを一時的に発現させ、neo耐性遺伝子のみを欠失したサイレント(S)アレルのES細胞クローンを選別し、コンディショナルマウス作製へと進んでいく予定である。
2.抗Q5抗体の作製。(1)ウサギへの免疫。マウスQ5のC端2カ所にそれぞれ17aa、20aaの合成ペプチドを設定し、これをウサギに免疫し抗血清を得ようとしている。これまでに8回の抗原投与が終わり、近々最終採血する。(2)この抗体のチェックのため、Q5発現ベクターを作製した。C端部分のみのものは大腸菌で発現させ、全長でN端、またはC端にタグをつけたものは動物細胞で発現することをそれぞれ確認した。