急性呼吸不全における低酸素反応性因子の役割に関する研究

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19590913
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 田坂 定智 Keio University, 医学部, 助教 (70276244)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山澤 稚子 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (50317137) ; 長谷川 直樹 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (20198724)
• Keywords: 低酸素反応性因子 / 急性呼吸不全

Research Abstract

平成21年度は、平成20年度に引き続き、培養細胞を用いてHIF-1遺伝子のノックダウンの影響について検討を行った。HIF-1遺伝子に相補的なヌクレオチド長の短い干渉RNA(siRNA)を作成したが、平成20年度に用いたものとは配列を変え、導入効率の向上と安定化を目指した。ヒト血管内皮細胞(HUVEC)や気道上皮細胞(Bes2b)にこのsiRNAを導入し、HIF-1の発現の効率的なノックダウンを目指した。導入直後の細胞ではHIF-1の遺伝子発現がほぼ消失していることが確認できたものの、一定時間培養後の細胞では導入効率が一定せず、HIF-1の発現が十分に抑えられていなかった。導入後の細胞に低酸素曝露やエンドトキシンなどの炎症性刺激を加えて、HIF-1および関連する分子であるVEGF、ET-1、PAI-1の発現を解析した。リアルタイムPCR法による遺伝子解析とウェスタンブロット法による蛋白レベルでの解析を行ったが、導入効率が一定しないことを反映してか、結果のばらつきが大きく、評価困難であった。またアデノウィルスベクターの気道内投与による、呼吸器系のHIF-1遺伝子ノックダウンの可能性について検討した。マウスの気道内にベクターを投与後に肺を摘出し、RNAを抽出し、リアルタイムPCR法によりHIF-1遺伝子の発現を評価した。ベクターの投与量や肺の摘出時間を種々に設定したものの、培養細胞での検討と同様に結果のばらつきが大きく、評価困難であり、一定の結論は得られなかった。