2008 Fiscal Year Annual Research Report
左右遺伝子invのコンディショナルマウスの作製と繊毛依存性腎疾患における意義
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19590965
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
土谷 健 Tokyo Women's Medical University, 医学部, 准教授 (00246472)
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| Keywords | siRNA / 左右軸 / ノックアウトマウス / アデノウィルス / マイクロアレイ / 培養細胞 |
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| Research Abstract |
1、コンディショナルノックアウトマウスの作製
Cre-loxPシステムによるコンディショナルジーンターゲッティングの方法を用いて、従来の研究期間に作製していたコンストラクトをもとにexon2を欠失させたinv遺伝子のターゲッティングベクターを作製した。コンストラクトは、ターゲットのexon2をはさむ位置にloxP siteを挿入し、PKG-neocasseteを方向マーカーとした。ベクターの構築を確認するために、PCRによるスクリーニングで、1〜10fmol濃度のDNA量でのスクリーニングが可能かどうかの検討を行った。また最終的にはSouthernblottingによる構築の確認も行った。
2、inv機能的遣伝子改変動物および細胞を用いたinvの生理学的、病態生理的意義の検討
前年度と同等の実験を継続した。機能的遺伝子改変を目的に、RNAiの発現vectorおよびadenovirusvectorをHydrodynamic法によりマウス個体、また従来の遺伝子導入により培養細胞で発現させ、mRNA発現レベルを調節した。
(1)マウス個体でのRNAi、およびadenovirusによる過剰発現:Hydrodynamic法により、invに特異的なRNAiを発現vectorおよびAdenovirusによる過剰発現を行った。腎臓でのinv遺伝子発現が抑制されたモデルおよび過剰発現したモデルが完成したため、関連遺伝子の検索を行うために、microarray法により検討した。
(2)培養細胞におけるRNAiおよびadenovirusによる過剰発現:同様のplasmidをtransfectionをmIMCD3 cell lineに行った。細胞間結合のゆるみが観察され、それらの細胞の網羅的遺伝子解析を行った。
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