2007 Fiscal Year Annual Research Report
脂肪および血管内皮細胞由来新規内分泌因子に関する研究
| Project/Area Number |
19591076
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
福原 淳範 Osaka University, 医学系研究科, 特任研究員 (00437328)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 守弘 大阪大学, 医学系・研究科, 特任研究員 (00362591)
|
|---|
| Keywords | Z5 / 生活習慣病 / ホルモン |
|---|
| Research Abstract |
血管内皮細胞由来の新規内分泌ホルモンの同定を試み、新規遺伝子(仮称:Z5)を見出した。Z5が脂肪、骨格筋、肝臓あるいは動脈壁に対していかなる生理機能を発揮するのか、Z5の発現上昇あるいは発現低下によってどのような生理的、病態的変化が起こるのかについて解析をおこなっている。
1)リコンビナントタンパク精製
ほ乳類細胞にHisタグ融合Z5を発現するプラスミドを一過性に導入した。培養上清を回収し、精製を行った。ニッケルビーズによる精製条件を検討した結果、イミダゾールを高濃度に添加することで溶出することができた。不純物を除去することは困難であったが、陰イオン交換カラムを用いて再度精製を行った。その結果、純度を上げることに成功した。本検討によって精製条件を決定することができた。
2)タンパク分秘機構の解析
HAタグ融合タンパクの安定発現細胞を作成した。HAタグに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって、本細胞ではZ5が細胞内および培養上清中に検出された。この時、ER-golgi経路の分泌阻害剤であるBrefeldinによってZ5の分泌が阻害された。また、培養上清および細胞内のZ5を非還元状態で泳動すると還元状態の約二倍の分子量の位置に検出された。これらの結果から、Z5はER-golgi経路によって分泌される因子であり、二量体を形成していることが示唆された。
3)Z5タンパクの分子修飾の解析
培養細胞で発現したZ5を各種のレクチンに対する抗体でプロットすると親和性が高いレクチンが同定され、Z5が糖鎖修飾されている可能性が示唆された。
4)遺伝子発現調節機構の解析
培養3T3-L1脂肪細胞にピオグリタゾンを添加し、mRNA発現を解析した。その結果、ピオグリタゾン刺激によってZ5のmRNA発現量が上昇することを見出した。
5)抗体作成
Z5の抗体を作成するために、大腸菌を用いたZ5リコンビナントタンパクの精製を開始した。
|
