膠原病患者血清中に存在する抗細胞表面抗体の対応抗原の解析と新たな検査法の確立

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19591188
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 三浦 惠二 Fujita Health University, 総合医科学研究所, 助教 (20199946)
• Keywords: 膠原病 / 自己抗体 / 自己抗原 / 細胞表面抗原 / 診断法

Research Abstract

(1)膠原病患者血清中に含まれる抗細胞表面抗体の検出法として、Cyto-ELISA法の有効性が前年度までの研究でわかった。しかし個々の患者が持つ自己抗体は、複数種類の抗体の集団であり、それらが他種類の細胞表面抗原を認識する場合が多かった。そのため、検出に使う材料を、細胞から可溶化粗精製タンパクへと移行し、最終的には個々の自己抗原を特定することで、自己抗体と自己抗原の組み合わせを明らかにでき、さらに症状との関連へと結びつけられると考えた。そこで、細胞膜表面抗原をビオチン標識後、細胞破砕・可溶化し、NeutrAvidin存介してELISAカップに固定して用いるELISA法を確立した。しかし、可溶化に用いる界面活性剤の種類により、Cyto-ELISAの結果を反映しない例も多く、可溶化による膜タンパクの構造変化によるものと思われた。現時点では、Dodecyl Maltosideによる可溶化に比較的汎用性が見いだされたが、数種の界面活性剤を使い分けるなどの検討が必要だと思われた。
(2)ヒトMCF-10A細胞を使用し、Dodecyl Maltosideで可溶化した膜タンパクに対して血清で免疫沈降を行うと、患者特異的なバンドを複数検出できた。特に分子量が、40および50kDa付近のバンドは、膠原病患者の約一割で検出された。このバンドを質量分析で同定しようとしたが、免疫沈降での回収量では少なすぎるため、未同定となっている。現在、回収率の向上を目指している。これまでの実験手法で、まずは一つ自己抗原と認識される細胞表面抗原を新たに同定すること。その後は、他のバンドについても、順次同定したい。臨床検査で使用されている自己抗原の多くが細胞内局在物質であるのに対し、当研究での対象は、「細胞表面に存在するもの」である。新たな細胞表面自己抗原が同定できれば、膠原病の解明に直接繋がるものと考えている。