グルタメイト脱水素酵素異常による高アンモニア血症の発症機構の解明と治療法の開発

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19591217
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 岡野 善行 Osaka City University, 大学院・医学研究科, 講師 (60231213)
• Keywords: 遺伝子 / 酵素 / 肝臓 / インスリン / アンモニア / 低血糖 / グルタメイト脱水素酵素 / トランスジェニックマウス

Research Abstract

高インスリン高アンモニア血症はGlutamate Dehydrogenase(GDH)のGTPの抑制制御が失われるため、GDH活性の上昇をきたし、肝細胞で高アンモニア血症を膵β細胞で高インスリン血症をもたらす。高アンモニア血症の発症機序は必ずしも明らかではなく、その発症機構の解明と治療法の開発のために、動物モデルを作成した。
L413V GDHcDNAをベクター(pASCXa)にサブクローニングし、DNAをカラム精製した。制限酵素Swalで切断後、アガロースゲルを用いて、CMVエンハンサー+chiken b-actinプロモーター+L413VcDNAを精製した。この遺伝子をマイクロインジェクション法により、マウスの受精卵へ導入した。変異GDHcDNAをユニバーサルに発現するトランスジェニックマウスを作成した。遺伝子の導入はL413V GDHcDNAの5'-と3'-の近傍領域をPCR増幅合成することで確認した。その結果、初回の遺伝子導入受精卵からは1系統の2回目の受精卵からは3系統のマウスが得られた。現在、その生化学的特徴を確認し、系統樹立後にアンモニア代謝の全身でのネットワークを考えた上で、GDH遺伝子異常の影響を検討する予定である。
上記マウスモデルに加え、変異GDHcDNAアデノウィルスを作成した。L413Vアデノウィルスでは4.5x10^9、G446Dアデノウィルスでは3.1x10^<10>、コントロールでは1.6x10^<10>plaque-forming units/mlをえることができた。マウスの腹腔内に投与するために、ウィルスを精製、濃縮したところである。限定された臓器に異常GDHが発現するマウスを作成する。