2007 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内微生物認識受容体クライオピリンの活性化によって誘導される細胞死の解明
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19591303
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
神戸 直智 Chiba University, 大学院・医学研究院, 講師 (50335254)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西小森 隆太 京都大学, 医学研究科, 助教 (70359800)
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| Keywords | CIAS1 / NLRP3 / cryopyrin / 細胞内微生物認識受容体 / 細胞死 / ASC / catyepsinB / TAPtag法 |
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| Research Abstract |
CIAS1がコードするクライオピリンは,細胞内微生物認識受容体として機能し,アダプター蛋白であるASCと会合しinflammasomeと呼ばれる蛋白複合体を形成,IL-1βのプロセシングに携わる。家族性寒冷葦麻疹に代表される自己炎症性疾患では,遺伝子異常の結果としてこのinflammasomeが活性化され,自発的なIL-1βの活性化がみられる。さらに我々は,CIAS1の疾患関連変異体をヒト単球細胞株へと導入した際に,cathepsinB依存性にネクローシス様の細胞死を誘導することを明らかにした。本研究においては,細胞内微生物認識受容体の活性化によって,周囲に炎症を惹起できるネクローシス様の細胞死が起こる機序を明らかにする目的で,ASCに会合する蛋白質をTAPtag法にてスクリーニングした。すなわち,ASCを構成するドメインであるCARDあるいはPYDをTAPtagベクターにクローニングした後にHEK293細胞に導入し、遺伝子を発現させた細胞抽出液と細胞死が誘導されるTHP-1細胞からの細胞抽出液とを混合して蛋白の複合体を形成させ,これをTAPtagに発現したprotainAとIgGとの会合を利用してIgGagarosebeadsで免疫沈降した。続いて、TEVproteaseで処理することでProt-Aを取り除き,会合した蛋白を上清として回収,続いてcalmodulinbindingprotein(CBP)を利用してカルシウムの存在下でcalmodulinbeadsで免疫沈降を行った。しかしながら,今回の実験系においては、残念ながら、この操作の後に蛋白質は抽出できなかった。現在は,計画書に記載したように,yeast2-hybrid法など別の実験手技を用いて,ASCに会合する蛋白質同定の検討を予定しており,その系の確立を目指している。
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