モータ蛋白プレスチンの膜発現様式と機能:プレスチン性難聴の病態の解明

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19591980
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 松田 圭二 University of Miyazaki, 医学部, 講師 (40253835)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 浩万 宮崎大学, 医学部, 准教授 (20204745) ; 東野 哲也 宮崎大学, 医学部, 教授 (80145424) ; 下薗 正巳 宮崎大学, 医学部, 助教 (80271138) ; 土屋 克之 宮崎大学, 医学部, 助教 (30468045)
• Keywords: モータ蛋白 / プレスチン / 外有毛細胞 / 膜発現 / 難聴

Research Abstract

膜でのプレスチンの機能単位を4量体と想定し、プレスチンミュータントのうちnon-functioning mutants with proper membrane targeting、つまり膜に発現されども働かないプレスチンが、そこでいかなる作用を及ぼしているのかを解析するために実験を計画した。このタイプのミュータントでは、ヘテロ接合体で正常プレスチンと複合体を形成し、プレスチンの正常な機能に何らかの影響を及ぼすことが予想される。細胞レベルでプレスチン機能を評価するには膜容量測定(ノンリニアキャパシタンスの測定)が最も適している。プレスチンミュータントが正常プレスチン機能にどの程度干渉するのかを定量的に評価でき、その結果は、in vivoの聴力ともよく相関することがわかっているからである。
プレスチンミュータントのうちnon-functioning mutants with proper membrane targeting、つまりそれ自体機能障害があるものの膜に発現する能力のあるプレスチンミュータントを正常プレスチンとともにほ乳類培養細胞(HEK293 cells)に共発現させ、パッチクランプによる電気生理学的な計測を行った。具体的には、膜電位変化に伴う膜容量の変化(ノンリニアキャパシタンス)を指標にプレスチン機能を評価した。
以下の3群について、(1)Wild Type(WT)のみ発現させたものをコントロールとして、(2)DNA量としてmutant: WT=1:1をヘテロ接合体として、(3)mutantだけ発現させたものをホモ接合体としてシュミレートし評価した。
結果:未だpreliminaryな結果であるが、(1)を100%としたときに、(2)は(3)とともに機能発現が0%であることがわかってきた。上記の群についてさらに膜へのタンパク発現量をウエスタンブロット法を行い評価をすすめている。