2007 Fiscal Year Annual Research Report
自家骨髄及び自家歯髄由来幹細胞の迅速大量培養による硬組織再生促進療法の臨床実用化
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19592207
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
池田 毅 Nagasaki University, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (90244079)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳口 嘉治郎 長崎大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (50264255)
山田 志津香 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (00363458)
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| Keywords | 迅速大量培養 / 減圧播種 / 還流培養 / キトサン多孔体 / ナノファイバー / 細胞移植療法 |
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| Research Abstract |
1:間葉系幹細胞増殖の効率化と骨芽細胞および象牙芽細胞への分化誘導促進化技術の開発
6週齢雄性ラット下顎骨から骨髄液を採取し、比重遠心法により骨髄間質細胞を抽出後、間葉系幹細胞(BMSCs)を分離する。分離した細胞に10%ラット血清を添加したDMEM培地で初代培養を行い、その後5%CO_2、37℃下で無菌的に継代培養操作に移行し、成長因子増殖法(線維芽細胞成長因子(bFGF)を1ng/ml培養液に添加)を応用し幹細胞の増殖培養の迅速化を図った結果、100mmの培養皿1×10^6cells播種し約14日後のコンフルエントとなった。キトサン投与の有無によるGene Fishing法とリアルタイムPCRによる増幅産物の厳密な定量分析によって、硬組織形成関連遺伝子(ALP,Osteocalcin,BMP-2,BSP,DSP,DMP-1等)の同定を行い、坦体としてのキトサン自身の幹細胞に対する硬組織形成賦活効果を検討したところ、0.005%添加した状態が最も上記遺伝子群の発現増強が確認できた。また細胞の多孔性坦体への侵入効率を上げるために減圧下(100mg)で細胞播種し、還流培養装置を用いて細胞が常に新鮮な培養液と接するような培養システムを試行錯誤中である。
2:Scaffoldの幾何学的三次元構造の解析
2%キトサン溶液をアンモニアガスにて中和させ、凍結乾燥処理をして得られたハニカム状凹型構造を有するスポンジ体を作成した。その際骨芽細胞および象牙芽細胞の坦体への細胞接着が良好となり、移植部位からの細胞拡散を防止するためpore sizeが200〜400μm、気孔率が70〜80%になるようキトサン溶液の濃度調整を行い、走査型電子顕微鏡にて確認できた。今後は細胞の坦体への侵入効率を上げるために減圧下(100mg)で播種し、さらに還流培養システムを用いて細胞へ常に新鮮な培養液と接するような実験系を作ることによって細胞増殖・分化が更に亢進することを目指す。
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