歯の萌出における転写因子活性制御の分子生物学的解析

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19592344
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 菊入 崇 Hokkaido University, 大学院・歯学研究科, 助教 (10322819)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大島 昇平 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助教 (00374546) ; 吉村 善隆 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助教 (30230816)
• Keywords: 歯胚 / カルシニューリン / in situ hybridizetion / 免疫組織化学

Research Abstract

本年度は、歯の萌出にカルシニューリンがどのように関与しているのかを免疫組織化学法およびin situ hybridization法を用いて検討した。
生後1、3、7、14、21、28日齢のマウスを4%パラホルムアルデヒドーリン酸緩衝液にて灌流固定し、歯胚領域を含む顎顔面部を摘出した。得られた試料はそれぞれEDTAによる脱灰過程の後、パラフィンにて包埋し、歯胚領域を含む厚さ5μmのパラフィン切片を作成した。その後、カルシニューリンAサブユニット(Aalpha、Abeta、Agamma)に対するウサギポリクローナル抗体(北海道大学大学院医学研究科解剖発生学講座より供与)を用いて、パラフィン切片の免疫組織化学的染色を行った。
すべての発育段階において、歯胚領域を含む広い領域でカルシニューリンAalphaおよびAbetaサブユニットの発現が認められた。しかし、カルシニューリンAgammaサブユニットの発現は認められなかった。一方、未脱灰凍結切片を用いたアイソトープ(P^<33>)によるin situ hybridization法および未脱灰パラフィン切片を用いた免疫組織化学法においては、歯胚領域にカルシニューリンAgammaサブユニットの発現が認められた。しかし、これらの結果は非特異的反応である可能性が否定できないため、カルシニューリンAgammaサブユニットのDIGラベリングcRNAプローブを用いて、脱灰パラフィン切片のin situ hybridization法を行った。その結果、カルシニューリンAgammaサブユニットの発現は確認できなかった。これら未脱灰試料と脱灰試料との発現確認の差異は、試料作成時の脱灰操作による検出感度低下の可能性があるため、試料作成方法の詳細を検討する必要があると考えられた。