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2008 Fiscal Year Annual Research Report

ランタニド結合配列を用いたエンドソーム・マクロピノソームの可視化

Research Project

Project/Area Number 19657048
Research InstitutionKobe University

Principal Investigator

廣明 秀一  Kobe University, 医学研究科, 特命教授 (10336589)

Keywordsバイオイメージング / 細胞内小胞輸送 / エンドソーム / マクロピノソーム / ランタニド結合タグ / タンパク質導入ドメイン
Research Abstract

本研究の目的は(1)わずか17アミノ酸残基の蛍光標識タグであるランタニド結合タグ(LBT)を用いた細胞生物学研究に適したバイオイメージング技術を確立すること、(2)とくにマクロピノサイトーシスやエンドソームのリサイクル現象を可視化すること、(3)新規のタンパク質細胞内導入ドメイン(PTD)を単離すること、の3点である。これらについて以下の成果を得た。
●哺乳動物細胞での遺伝子発現ベクターpCDNA3.1にクローニングされた遺伝子に、LBTタグを付加して培養細胞でのタンパク質の発現を確認した。マクロピノサイトーシス時の細胞骨格の再構成の可視化に向けて、別途GFP-tubulinの安定発現細胞株の樹立を行った。LBTで可視化した別の細胞骨格・エンドソーム関連因子との二重染色の実験は現在進行中である。
●ヒトの蛋白質由来の新規PTD配列2種(IGFBP-3/IGFBP-5)を単離同定し、その細胞内導入の経路が
HIV-TATと同様のヘパリン依存的マクロピノサイトーシス経路であることを明らかにした(Exp.Cell Res.,314 2352-2361.(2008))。
●IGFBP-5由来の新規PTD配列のヘパリン結合時の立体構造を調べた結果、HIV-TATと異なりa-helix構造が誘導されないことが明らかになった。この差がIGFBP由来PTDとHIV-TATの導入速度の差に関連して,いる可能性がある。
●京都大学との共同研究を行い、LBT-PTD-二重タグ付きUbが活用して導入効率の向上を検定した。
HIV-TAT由来PTDを用いて蛋白質導入を行い、最終的に生きたヒト細胞に15N標識した蛋白質を導入し
その多次元NMRを測定するIn-cell NMRP技術の確立に貢献した(Nature458106-109(2009)).
これらの研究は、おおむね研究実施計画どおりに進行しており、マクロピノサイトーシスの観察手法とし
てのLBT蛍光イメージング法はほぼ実用化できた。

  • Research Products

    (4 results)

All 2009 2008

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells.2009

    • Author(s)
      猪股晃介
    • Journal Title

      Nature 458

      Pages: 106-110

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Intracellular protein delivery activity of peptides derived from insulin-like growth factor binding proteins 3 and 5.2008

    • Author(s)
      合田名都子
    • Journal Title

      Experimental Cell Research 314

      Pages: 2352-2361

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] クラスB GPCR細胞外ドメインのペプチドリガンド分子認識機構2008

    • Author(s)
      天野剛志
    • Journal Title

      生化学 80

      Pages: 948-958

  • [Presentation] A method for high-throughput construction of bacterial protein expression vector and its application for cell biology.2008

    • Author(s)
      廣明秀一
    • Organizer
      米国蛋白質科学会第22回年会
    • Place of Presentation
      サンディエゴ(アメリカ)
    • Year and Date
      2008-07-22

URL: 

Published: 2010-06-11   Modified: 2016-04-21  

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