2007 Fiscal Year Annual Research Report
転写と共役したDNA修復とmRNAスプライシングとの連携の解析
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19657051
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
片岡 直行 Tokyo Medical and Dental University, 難治疾患研究所, 特任講師 (60346062)
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| Keywords | 転写 / DNA修復 / スプライシング / in vitro転写系 |
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| Research Abstract |
これまでに我々は、in vitroスプライシング反応系を用いてスプライシング後のラリアットイントロンRNA複合体の解析から、イントロンの代謝に関わる因子群の候補中にhPRP19やXab2といった、転写と共役したDNA修復(Transcription coupled DNA repair,TCR)機構に関わる因子群を同定した。また、これらの因子がイントロンの代謝因子hDBRIと会合していることも見いだした。これらのことは、真核生物の核内におけるmRNAスプライシング機構と、転写と共役したDNA修復機構との新たな連携を強く示唆していた。しかし、in vitroにおける解析系がないため、TCRの機構についてはほとんど解析されていない。そこで本研究では、転写と共役したin vitroスプライシング反応系に損傷の入った鋳型DNAを用いて、細胞内でのTCRを模擬したin vitro反応系を構築することで、TCR機構の解明を目指している。
β-globin, δ-crystallin, Adeno virus MLP遺伝子の二つのエクソンとその間のイントロンを含む嶺域をPCR法により増幅し、CMV promoterを持つプラスミドにグローニングした。そしてCMV promoterを付けた形で増幅した断片をin vitroでの共役系の鋳型として用いた。これらの鋳型をHeLa細胞核抽出液と混合し、反応を行ったところ、目的の大きさのmRNA前駆体の転写や、その後のスプライシングによって産生されたmRNAを観察することができた。また、同時にこれらのmRNAを最初からイントロンを除いた形で発現する鋳型も同時に構築し、in vitroでの共役系でmRNAの発現が確認できた。また、より複雑な系での解析を目指し、三つのエクソンとその間の二つのイントロンを含む鋳型を、β-globin,δ-crystallin遺伝子を用いて構築した。
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