2007 Fiscal Year Annual Research Report
コンディショナルノックアウトによる間葉系幹細胞から肝細胞への分化可塑性の解析
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19659185
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
汐田 剛史 Tottori University, 大学院・医学系研究科, 教授 (70263457)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星川 淑子 鳥取大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (10181489)
土谷 博之 鳥取大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (00403402)
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| Keywords | 間葉系幹細胞 / 肝細胞 / 分化可塑性 / コンディショナルノックアウトマウス / floxマウス / Cre発現トランスジェニックマウス / 再生医学 / 再生医療 |
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| Research Abstract |
1.研究成果の具体的内容
[間葉系細胞発現するCre recombinaseベクターの作成]
(1)pcDNA6-Creプラスミドの作製;pPGK-CreIIからCre遺伝子をPstIとSalIで切り出し、PstIとXhoIで切断し直鎖状となったベクターpcDNA6/V5-Hisに組み込み、pcDNA6-Creと名付けた。
(2) Cre-EGFP-1プラスミドの作成;pcDNA6-CreをテンプレートとしPCR反応を行った。PCR産物とpEGFP-1は50ngのCREと100ngのpEGFP-1をライゲーション反応させた。
(3) pENTR-CreEGFP作製;pCreEGFPをテンプレートとしPCR反応を行った。PCR産物とpDONR221をBPclonaseによって組み換え反応させ、pENTR-CreEGFPを作成した。
(4) pLenti6-CreEGFP作製;LRclonaseIIを用いてpENTR-CreEGFPとpLenti6/V5-DESTを組み換え反応させた。
(5) DsRed発現制御によるCreリコンビナーゼの機能確認;肝癌細胞株HuH-7にpLenti6-CreEGFPとpLXL-DsRedを遺伝子導入し、機能確認した。
(6) 間葉系細胞のマーカーとして、NGFRが最も適当と判断され、RT-PCRによる各臓器での発現を解析した。脳、脾臓、腎臓に強く発現した。
(7) NGFRプロモーター/Cre発現ベクターの作成;左記ベクターを作成し、シークエンス及び一過性発現実験で発現を確認した。
2.研究成果の意義と重要性
一連の研究より間葉系細胞で発現するCre recombinaseベクターを作成した。今後、本ベクターにより、トランスジェニックマウスを作成し、ベータカテニンのfloxマウスとの高配により、コンディショナルノックアウトによる間葉系幹細胞から肝細胞への分化可塑性の解析が可能となる。
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