2009 Fiscal Year Annual Research Report
特異な酵素反応系を利用した新規細胞内ATPモニターリングシステムの開発
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19750063
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
末田 慎二 Kyushu Institute of Technology, 大学院・情報工学研究院, 准教授 (00325581)
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| Keywords | ATP検出 / ビオチン化酵素 / 蛍光タンパク質 / 蛍光共鳴エネルギー移動 |
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| Research Abstract |
前年度までに構築した、BPLとEGFPの融合タンパク質、及びBCCPとEBFPの融合タンパク質を用いて、細胞破砕溶液中に含まれるATPの検出を試みた。細胞破砕溶液中にATPを添加して、BPLとBCCPのそれぞれの融合タンパク質を用いて、ビオチン化反応を行なったところ、EBFPからEGFPへの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が確認できた。このことより、細胞成分が共存する条件下でも特異的にビオチン化反応が起こり、FRETを指標とした、ATPの検出が可能であることがわかった。次に、ヒト細胞系におけるATPの検出系の構築を目的として、まずBCCPとEGFPのヒト細胞中での発現系を構築した。この際、元々の古細菌由来のBCCPに関してコドンの使用頻度を確認したところ、ヒト細胞系での発現が困難であることが推測されたため、ヒト細胞での発現に最適化したコドンを有するBCCP遺伝子を作製した。このコドンを最適化したBCCPを、 EGFPのN末端に連結した融合タンパク質の発現プラスミドを作製し、HEK293細胞に対してトランスフェクションを行なった。細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、EGFP由来の蛍光が観察でき、ヒト細胞内においても目的の融合タンパク質が発現することが確認できた。同様にBPLに関してもコドンを最適化した遺伝子を作製し、ヒト細胞系での発現系を構築した。さらに、HEK293細胞の表層におけるビオチン化反応の確認を行なった。すなわち、膜タンパク質とBCCPの融合タンパク質をHEK293細胞上に発現させ、蛍光標識化したBPLを用いて、ATP共存下ビオチン化反応を行なった。その結果、期待通り細胞表層から蛍光色素に由来する蛍光が観察できた。一方でATP非共存下ではこのような蛍光は観察できなかったため、細胞表層においてもATPを検出することが可能であることがわかった。
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