2007 Fiscal Year Annual Research Report
トランス翻訳特異的な蛋白質SmpBが引き起こすリボソームの動態解析
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19770143
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
清水 義宏 The University of Tokyo, 大学院・新領域創成科学研究科, 助教 (90401231)
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| Keywords | リボソーム / トランストランスレーション / 翻訳 / SmpB / tmRNA / キロマイシン |
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| Research Abstract |
本年度では、SmpB変異体の生化学的解析及び一分子イメージング技術を用いたSmpB及びリボソームの相互作用解析を行うための基盤構築の二点を実施した。一点目については、よく保存されているSmpBのC末端アミノ酸配列中において保存性の高い残基のアラニン置換変異体及びそれらの欠失変異体を作製し、それらのリボソームAサイトへのエントリー及びEF-Tuに結合したGTPを加水分解する活性の測定を行った。結果、C末端欠失変異体がAサイトエントリーを引き起こさない点、また、これらの変異体がGTP加水分解反応速度を低下させる点を見出した。さらに、該当反応に対する、EF-Tu濃度・tmRNA濃度・SmpB濃度の影響を測定し、反応のターンオーバーレートを算出し、通常のEF-TuまたはEF-Gが引き起こすリボソーム上での反応と同様の反応が進行していることを示唆するデータを得た。二点目については、遺伝学的手法によりアビジンタグを導入したリボソーム蛋白質を保持したリボソームを調製し、ガラス基盤への固定化の検討を行い、リボソームをガラス基板上の輝点として観察することに成功した。しかしながら、非特異的吸着も多数観察され、次年度では、これらの非特異的吸着を抑えるために、様々な条件検討を行う予定である。また、N末にCysを導入したSmpBを用いて蛍光標識を導入したSmpBを調製した。このSmpBを用いて、蛍光顕微鏡によってSmpBとリボソームの相互作用解析を行い、EF-Tuまたは抗生物質キロマイシンの存在下・非存在下におけるイベント数の変化を観察し、輝点の明滅がEF-Tu依存的であることを示唆するデータを得た。
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