血球における受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19770165
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 真嶋 隆一 The University of Tokyo, 医科学研究所, 助教 (00401365)
• Keywords: チロシンキナーゼ / シグナル伝達 / リン酸化

Research Abstract

本研究の目的は受容体チロシンキナーゼの会合分子、もしくは、基質分子の探索とそれらを介したシグナル伝達機構を明らかにすることにある。特に、血球における受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達機構を解明するため、造血前駆細胞と一部の樹状細胞に発現するFlt3、およびその類縁分子に注目し、機能解析を行なった。特に平成20年度は下記の研究を実施した。
【Flt3会合分子の探索】昨年に引き続き、Flt3に会合する分子を探索した。このため従来より用いられているアフィニティー精製と、SILAC法による同定を目指した。その際、細胞可溶化液からのFlt3とこれに会合する蛋白質の回収を容易にするため、Flt3cDNAにFLAGタグを付加した発現ベクターを構築した。次にFlt3が機能的でかつ安定的に発現する培養細胞株の作製を試みた。しかしながら、繊維芽細胞に遺伝子を導入して薬剤選択を行ったものの、安定発現株は取得できなかった。そこで遺伝子発現方法をリン酸カルシウム法による一過性発現系とし、Flt3リガンド刺激依存的に基質分子のチロシンリン酸化が検出される実験系をHEK293T細胞にて構築し、会合分子の探索を試みた。しかしながら、回収された会合分子の量が少なかったために、当初予定していた質量分析法による同定には至らなかった。
【Flt3の基質分子の探索】Flt3の基質分子の探索を行なった。その結果、分子量約60kDaのタンパク質が基質候補として考えられた。そのため、一過性過剰発現系を用いてこのタンパク質をFlt3と共発現させたのち、これらの発現細胞にFlt3リガンド刺激を加えた。その結果、予想通り、このタンパク質のFlt3リガンド依存的なチロシンリン酸化が確認された。