2007 Fiscal Year Annual Research Report
ピーナッツ主要アレルゲンの立体構造解析と重篤症状を引き起こす構造要因の解析
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19780097
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
増田 太郎 Kyoto University, 農学研究科, 助教 (40395653)
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| Keywords | アレルギー / 食品 / タンパク質 / 植物 |
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| Research Abstract |
ピーナッツ主要アレルゲンの精密な立体構造を決定し、アレルゲン性と立体構造の関連について検討を加えるため、主要アレルゲンの一つであるAra h 1について、まず大腸菌発現系を用いた試料タンパク質の調製を行った。具体的には、ピーナッツ登熟種子より調製したmRNAを鋳型としてRT-PCRを行い、Ara h 1のcDNAをクローニングした。このcDNAをタンパク質発現用プラスミドpET21dに挿入することにより大腸菌発現系を構築し、組換え型Ara h 1の大量発現と精製を行い、精製試料を用いて結晶化条件を検索した。その結果、0.1MのMES緩衝液(pH=6.5)中で、4%のPEG20000を沈殿剤としてAra h 1の単結晶を得ることに成功した。得られたAra h 1結晶のX線回折データを、Spring-8放射光施設において取得したところ、3.5Åまでのデータを収集し、空間群P1、格子定数a=91.17,b=95.98,c=157.85,α=107.59°,β=92.19°,γ=110.20°と決定することができた。現在、更に高分解能のデータを取得し、Ara h 1の立体構造とアレルゲン性の相関を精緻に解析するため、高品質のAra h 1結晶の調製を試みている。他方の主要アレルゲンであるAra h 3についても、cDNAをクローニングし、種々の大腸菌発現系の構築、組換え型Ara h 3の発現条件の検討を行った。その結果、Ara h 3のN-末端にマルトース結合タンパク質を融合し、大腸菌 Rosetta株を発現用宿主とした条件において、組換え型Ara h 3を可溶性タンパク質として発現させることに成功した。現在、組換え型Ara h 3の大量発現を試みており、精製条件の検討を行っている。
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