Lmx1a相同性遺伝子導入ES細胞を用いたドーパミン産生細胞の分化誘導と移植治療

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19790220
• Research Institution: St.Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 千葉 俊明 St.Marianna University School of Medicine, 医学部, 講師 (20367361)
• Keywords: 胚性幹細胞 / パーキンソン病 / 相同性遺伝子導入 / 移植治療

Research Abstract

A)ヒトおよびマウスLmxlaをデータベース上で比較・解析し、マウスでは不明であったpromoter領域をexonlの220bp上流に発見した。Exon1、exon2はLmx1bとの共通配列のhomeobox domainであり、Lmx1bの補足的な働きによる非特異的GFP発現をさけるため、Lmx1aに特異的であるexon3をZsGFP遺伝子に置換する形で設計を変更した。exon1、exon2を含む約2.4kbpの5'armと約5.4kbpの3'armをC57BL/6genomic DNAよりPCRで作製し、pMClox-Neo-lox targeting vectorのTK-Neo配列後に3'armを挿入、その後5'armおよびZsGFP遺伝子を順次挿入することで、全長12kbpのLmxla targeting vectorを作製した。Nucleofectorにて5x10^6個のマウスES細胞に25μgの直線化targeting vectorを遺伝子導入し、一週間のG418選択後に耐性コロニーを約300個採取し、PCRにてnegative selectionとpositive selectionを行い、相同性遺伝子導入株を10株選択した。現在、5'および3'側の組み換えの確認と不要遺伝子の挿入がないことをサザンプロット法にて確認している。B)新規分化誘導法では、胚様体形成中に5ng/ml FGF8と500ng/ml nogginを添加することでpitx3、TH二重陽性のdopamine細胞を効率よく分化誘導できることを発見した。高濃度のFGF8、もしくは胚様体形成後の投与では上記条件と比較し、著しく陽性細胞の減少がみられた。C)パーキンソンモデルラットを作製し、薬剤誘発回転運動テストで成功率(24/30匹=約70%)を確認した。