三次元培養肝細胞を利用した肝炎ウイルス感染モデルの開発

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19790503
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 村上 恭子 National Institute of Infectious Diseases, ウイルス第二部, 主任研究官 (30399456)
• Keywords: 三次元培養 / HBV / HEV

Research Abstract

欧米型,日本型のHBV計3株について,完全長遺伝子をクローニングした。このHBVゲノムをタンデムに結合し,ウイルス発現用ベクターを構築した。Huh7細胞に導入後,細胞内及び上清中のHBV関連抗原の発現を確認した。また,既存のELISAシステムを応用,改変し,HBsAgの定量系を導入した。
HEVは患者便中からRNAを抽出し,完全長ゲノムRNAをcDNAとしてクローニングした。ウイルス蛋白の発現は抗体の問題によりできなかった。そこで,抗体作成のための抗原として利用するため,各種HEV蛋白を大腸菌で発現し精製をおこなった。
次に各種細胞の三次元培養条件について検討を行った。肝癌由来細胞株としてよく研究に用いられているHuh7細胞及びHepG2細胞の三次元培養条件を検討し,温度感受性ゲルでの培養条件を決定した。また,アルブミン産生能,及び薬剤代謝遺伝子の発現上昇等複数の項目について,検討を行い,三次元培養により生体肝に近い機能を有していることを確認した。HEV感染及び複製が報告されているAlexander細胞についても同様に三次元培養条件を検討した。この細胞は三次元培養により増殖速度があがること,またゲルを用いて三次元化した後にはゲルから取り出して低吸着性dishでの培養が可能であることが明らかになった。
以上,H19年度はHBV及びHEVのゲノムのクローニング,及び検出系の確立をおこなった。また,感染実験に用いる細胞にっいて詳細に検討をおこなった。本研究計画の中心である感染性への検討をおこなう準備はほぼ完了したが,HEVについては抗体作製という課題がのこされた。また,HEVの感染及び複製が報告されているAlexander細胞は,HEV複製及び感染がおこらないHuh7細胞およびHepG2細胞とは三次元化した際の増殖速度及びスフェロイド形成後の足場(温度感受性ゲル)依存性に違いがあった。三次元化後の細胞の性質に関与する宿主因子がHEV複製に関与している可能性も考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Dynamic behavior of hepatitis C virus quasispecies in a Iong-term culture of the three-dimensional radial-flow bioreaator system (2008)
  • Author(s): Kyoko Murakami. Yasushi Inoue, Su-Su Hmwe, Kazzuhiko Omata, Tomokatsu Hongo, Koji Ishii, Sayaka Yoshizaki, Hideki Aizaki, Tomokazu Matsura, Shoji, Tatsuo Miyamura, and Tetswo Suzuki
  • Journal Title: J.Virol.Methods 148(1-2) Pages: 174-181
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular biology of hepatitis C virus (2007)
  • Author(s): Suzuki T, Aizaki H, Murakami K, Shoji I, Wakita T;
  • Journal Title: J Gastroenterol 46(6) Pages: 411-423
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transcriptomic comparison of human hepatoma Huh-7 cellclones with different hepatitis C virus replication efficiencies (2007)
  • Author(s): Inoue Y, Murakami K. Hmwe SS, Aiaki H, Suzuki T.
  • Journal Title: Jpn J Infect Dis.60(4):173-8 60(4) Pages: 173-178
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The E6AP ubiquitin ligase mediates ubiquitylation and degradation of hepatitis Cvirus core protein (2007)
  • Author(s): Masayuki Shirakura, Kyoko Murakami, Tohru Ichkmura, Ryosuke Suzuki, Tetsu Shimoji, Kouichirou Fukuda, Katsutoslu Abe, Shigeko Sato, Masayoshi Fukasawa, Yoshio Yamakawa, Masahiro Nishijima, Kohji Moriishi, Yoshiharu Matsuura, Takaji Wakita, Tetsuro Suzuki;
  • Journal Title: J.Virol 81(3) Pages: 1171-1185
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 血球系細胞におけるHCVJFH-1株の感染および複製の検討 (2007)
  • Author(s): 村上 恭子、勝二 郁夫、木村 敬郎、鈴木 哲朗、宮村 達男、脇田 隆字
  • Organizer: 血球系細胞におけるHCVJFH-1株の感染および複製の検討
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 20071000
• [Presentation] HCVコア蛋白と結合する新規宿主因子kmRNPHIIH2の同定と相互作用解析 (2007)
  • Author(s): 阿部 克俊、勝二 郁夫、村上 恭子、奈須 純一、高宮 智史、大崎 一直、鈴木 哲朗、宮村 達男、小池 和彦、脇田 隆字
  • Organizer: 第55回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 20071000
• [Presentation] Virological characterization of.HCV JFH-1 stain in B-lymphocytes (2007)
  • Author(s): Murakami K., Shoji I., Hamamoto I., Suzuki T., Miyamura T., Wakita T.
  • Organizer: 14th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: イギリス(グラスゴー)
  • Year and Date: 2007-09-10
• [Presentation] Celluar vimentin content affects the protein level of hepatitis C virus core protei n and the activity of hepatitis C virus production in cultured cells (2007)
  • Author(s): Fukasawa M., Nitahara-Kasahara Y., Shinkai-Ouchi F., Sato S., Suzuki T., Murakami K., Wakita T., Hanada K Miyamura T., Mishijima M.
  • Organizer: 14th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • Place of Presentation: イギリス(グラスゴー)
  • Year and Date: 2007-09-10